Lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat weist überlegene osteogene Eigenschaften bei der lateralen Augmentation des Unterkiefers auf

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1422 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei der Rekonstruktion zahnloser Patienten ist häufig ein Mangel an Knochenvolumen für die Platzierung von Zahnimplantaten ein Problem. Obwohl Autotransplantate der Goldstandard für die Kieferregeneration sind, stimuliert die mit der Entnahmestelle verbundene Morbidität die Nachfrage nach anderen Ersatzstoffen. Ziel dieser Studie ist es, den Einbau und die osteogene Fähigkeit eines lebensfähigen kryokonservierten menschlichen Knochentransplantats (VC-HBG) bei der Unterkieferaugmentation bei Ratten zu charakterisieren. Knochensplitter von frischen menschlichen Wirbelkörperspendern wurden verarbeitet, kryogeschützt und bei –80 °C tiefgefroren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Ein Kiefervergrößerungsmodell wurde bei 20 athymischen Nacktratten verwendet, die in zwei Gruppen aufgeteilt wurden, um entweder das VC-HBG oder ein azelluläres Transplantat als Kontrolle (A-HBG) zu erhalten. Die Beurteilung der Eingliederung der Transplantate erfolgte nach 4 und 8 Wochen mittels Mikro-CT, Histomorphometrie und Immunhistochemie. Der Knochenvolumenzuwachs war in der VC-HBG-Gruppe zu beiden Zeitpunkten signifikant höher. Nach 4 Wochen wies die A-HBG-Gruppe eine deutlich höhere Mineraldichte auf, nach 8 Wochen zeigte die VC-HBG-Gruppe jedoch deutlich höhere Werte als die A-HBG. Es gab nach 4 Wochen keinen statistischen Unterschied zwischen der VC-HBG- und der A-HBG-Gruppe hinsichtlich der verbleibenden Transplantatpartikel, während die VC-HBG-Gruppe nach 8 Wochen deutlich weniger Transplantatreste aufwies. Die Expression von Kollagen I, Osteopontin und tartratresistenter saurer Phosphatase war in der VC-HBG-Gruppe zu beiden Zeitpunkten signifikant höher, während die Osteocalcin-Expression in der VC-HBG-Gruppe nach 8 Wochen signifikant höher war als in der A-HBG-Gruppe. Diese experimentelle Untersuchung zeigte, dass das VC-HBG im Vergleich zum A-HBG positive osteogene Eigenschaften, eine stärkere Knochenbildung, eine höhere Knochenumbaurate und eine insgesamt bessere Einbindung in den Unterkiefer von Ratten aufweist.

Knochenatrophie ist eine physiologische Folge nach Zahnverlust und führt häufig zu einer unzureichenden Struktur zur Stabilisierung von Zahnimplantaten, was zu höheren Ausfallraten, unbefriedigenden ästhetischen Ergebnissen oder einem schlechten prothetischen Design führt. Um das Knochenvolumen und die Alveolarkammanatomie vor der Implantatinsertion angemessen zu rekonstruieren, stehen dem Kliniker derzeit verschiedene chirurgische Techniken und Biomaterialien zur Verfügung1,2. Autologe Transplantate wurden ausführlich untersucht und die wissenschaftliche Literatur berichtet über günstige Ergebnisse mit guten Erfolgsraten, wobei ein effektiver und stabiler Volumenzuwachs ohne Bedenken hinsichtlich der Immunantwort oder der Krankheitsübertragung erzielt werden konnte. Daher gelten Autotransplantate als Goldstandardmaterial für den Knochenaufbau im Dentalbereich3,4. Allerdings haben die mit der chirurgischen Entnahmestelle des Spenders verbundene Morbidität und das Risiko von Komplikationen wie Parästhesien, Blutungen, Schäden an lebenswichtigen Strukturen und übermäßigen Ödemen die Forscher dazu ermutigt, die Entwicklung von Transplantationsbiomaterialien anzustreben, die den autogenen Knochen während des Alveolarkamms erfolgreich ersetzen können Augmentationsverfahren5,6,7.

Die osteogenen Eigenschaften von Autotransplantaten beruhen auf ihrem einzigartigen Gehalt an lebensfähigen Zellen und induktiven Proteinen. Der Dreiklang des Tissue Engineering wird mit Zellen, chemischen Signalen und einem geeigneten Gerüst erreicht, das es den Zellen ermöglicht, zu migrieren, sich anzuheften und neues Gewebe zu produzieren1. Aus dem Knochenmark stammende Stromazellen (MSCs) haben das Potenzial, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren, einschließlich knochenbildender Osteoblasten. Die Versuche, Knochentransplantate mithilfe von MSCs zu verbessern, haben eine größere und schnellere Knochenvolumenbildung im Vergleich zu üblicherweise verwendeten Biomaterialtransplantaten gezeigt8,9. In einer kürzlich von unserer Forschungsgruppe durchgeführten Studie wurde beobachtet, dass Mikropartikel menschlicher Leichenknochen, die mit aus Knochenmark isolierten MSCs besiedelt waren, positive osteogene Eigenschaften aufwiesen, was im Vergleich zu deutlich schnellerer Knochenbildung zusammen mit einer höheren Knochenumsatzrate und einem besseren Gesamteinbau führte ihr azelluläres Gegenstück10. In jüngerer Zeit hat eine neue Methode zur Verarbeitung menschlicher Knochen die Herstellung eines Knochentransplantationsmaterials ermöglicht, das seinen lebensfähigen Zellinhalt während der Kryokonservierung bewahrt.

Ziel dieser Studie ist es, den Einbau zu charakterisieren und die osteogene Fähigkeit dieses neuartigen lebensfähigen kryokonservierten menschlichen Knochentransplantats (VC-HBG) während der seitlichen Unterkieferaugmentation bei Ratten zu bestimmen.

Das verwendete chirurgische Verfahren wird im Abschnitt Material und „Methoden“ ausführlicher beschrieben. Alle Tiere vertrugen die Operationen gut und es wurden keine unerwünschten Ereignisse postoperativ beobachtet. Auch Anzeichen von Infektionen, die die histologischen, immunhistochemischen und tomographischen Analysen beeinträchtigen könnten, lagen bei allen Tieren nicht vor.

Die durch Mikro-CT analysierten quantitativen Variablen werden in Tabelle 1 anhand von Mittelwert, Median, Standardabweichung, Minimum, Maximum und Interquartilbereich nach Transplantattyp dargestellt.

Nach 4 Wochen war der durchschnittliche BV in der VC-HBG-Gruppe deutlich höher (34,97 ± 4,97 mm3) als der Mittelwert der A-HBG-Gruppe (12,43 ± 2,53 mm3, p < 0,001). Nach 8 Wochen gab es auch einen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,002) zwischen dem mittleren BV in der VC-HBG-Gruppe (48,59 ± 3,99 mm3) und der A-HBG-Gruppe (35,18 ± 4,98 mm3), siehe Abb. 1A. VC-HBG zeigte nach 4 und 8 Wochen ein signifikant größeres Volumen als A-HBG-Transplantate (p < 0,001).

Zusammenhang zwischen Knochenvolumenzuwachs (mm3) (A), Knochenmineraldichte (BMD) (B), Prozentsatz des Knochenvolumens (C), Verhältnis von Knochenoberfläche zu Gesamtvolumen (D) und Transplantattyp zu jedem Zeitpunkt. A-HBG azelluläres menschliches Knochentransplantat, VC-HBG lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat.

Nach 4 Wochen wies die A-HBG-Gruppe eine deutlich höhere Mineraldichte (0,71 ± 0,04 mg/cm3) auf als die VC-HBG-Gruppe (Mittelwert = 0,62 ± 0,06 mg/cm3, p = 0,032). Umgekehrt hatte die Gruppe, die VC-HBG erhielt (Mittelwert: 0,63 ± 0,03 mg/cm3), nach 8 Wochen signifikant höhere Werte (p = 0,025) als die A-HBG-Gruppe (Mittelwert: 0,58 ± 0,04 mg/cm3). siehe Abb. 1B.

Nach 4 Wochen war der mittlere PBV der A-HBG-Gruppe höher als der der VC-HBG-Gruppe (63,22 ± 8,55 % bzw. 46,25 ± 4,36 %), p = 0,004. Allerdings zeigten die A-HBG- und VC-HBG-Gruppen nach 8 Wochen keinen statistisch signifikanten Unterschied (p > 0,05), siehe Abb. 1C. VC-HBG-Transplantate zeigten nach 8 Wochen einen signifikant niedrigeren PBV als A-HBG nach 4 Wochen (p = 0,004).

BS/VR waren für die VC-HBG-Gruppe (23,49 ± 1,61) im Vergleich zur A-HBG-Gruppe (17,41 ± 3,19) zum Zeitpunkt 4 Wochen signifikant höher, wie in Abb. 1D gezeigt (p = 0,005).

Beschreibende quantitative histomorphometrische Variablen werden in Tabelle 2 anhand von Mittelwert, Median, Standardabweichung, Minimum, Maximum und Interquartilbereich nach Transplantattyp dargestellt.

Der Prozentsatz neu gebildeten Knochens innerhalb des transplantierten Bereichs war in der VC-HBG-Gruppe in beiden Zeitintervallen signifikant höher (p = 0,001), siehe Abb. 2A und C.

Zusammenhang zwischen Knochenneubildung (A), Transplantatresten (B) und Transplantattyp zu jedem Zeitpunkt. Repräsentative H&E-Bilder sind in (C) mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung dargestellt. A-HBG azelluläres menschliches Knochentransplantat, VC-HBG lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat.

Nach 4 Wochen gab es keinen statistischen Unterschied zwischen der VC-HBG- und der A-HBG-Gruppe hinsichtlich des Prozentsatzes der verbleibenden Transplantatpartikel (p = 0,047). Nach 8 Wochen wies die VC-HBG-Gruppe einen deutlich geringeren Prozentsatz an Transplantatresten auf als die A-HBG-Gruppe (8,07 ± 4,55 % vs. 20,93 ± 11,37 %; p = 0,047), siehe Abb. 2B und C.

Quantitative immunhistochemische Variablen werden anhand des deskriptiven Mittelwerts, des Medians, der Standardabweichung, des Minimums, des Maximums und des Interquartilbereichs nach Transplantattyp in Tabelle 3 dargestellt. Die Osteocalcin (OCN)-Expression war in der VC-HBG-Gruppe bei 8-10 % signifikant höher (p < 0,001). Wochen (230,49 ± 56,34 Pixel, px) im Vergleich zur A-HBG-Gruppe (151,59 ± 29,23 px), siehe Abb. 3A. Insgesamt zeigten Transplantate nach 8 Wochen (216,95 ± 54,78 px) eine signifikant höhere OCN-Expression (p = 0,006) als solche nach 4 Wochen (165,14 ± 54,72 px), siehe Abb. 3A. Zu beiden Zeitpunkten war die Kollagen I (COL 1)-Expression in der VC-HBG-Gruppe signifikant höher (p = 0,021 nach 4 Wochen und p = 0,050 nach 8 Wochen), siehe Abb. 3B. Die Osteopontin (OPN)-Expression war in der VC-HBG-Gruppe in beiden Zeitintervallen signifikant höher (p < 0,001) (p < 0,001 sowohl für die Zeitpunkte 4 Wochen als auch 8 Wochen), siehe Abb. 3C. Die Expression der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) war in der VC-HBG-Gruppe zu beiden Zeitpunkten signifikant höher. Nach 4 Wochen betrug die TRAP-Expression in der A-HBG-Gruppe 1,10 ± 0,25 Zellen/Sichtfeld (FOV) und 1,92 ± 0,47 Zellen/FOV in der VC-HBG-Gruppe (p = 0,009). Nach 8 Wochen war die TRAP-Expression für die VC-HBG-Gruppe (2,06 ± 0,57 Zellen/FOV) signifikant höher (p = 0,016) als für die A-HBG-Gruppe (1,02 ± 0,51 Zellen/FOV), siehe Abb. 3D.

Zusammenhang zwischen OCN (A), COL1 (B), OPN (C), TRAP (D) und Transplantattyp zu jedem Zeitpunkt. Azelluläres menschliches Knochentransplantat aus A-HBG, lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat aus VC-HBG, OCN-Osteocalcin, COL1-Kollagen Typ 1, OPN-Osteopontin, TRAP-tartratresistente saure Phosphatase.

Vor dem Einsetzen von Zahnimplantaten ist häufig ein Knochenaufbau im Kiefer erforderlich. Trotz der Entwicklung mehrerer Biomaterialien und unterschiedlicher Techniken nimmt der Prozess der Eingliederung Zeit in Anspruch und führt häufig zum Verlust des ursprünglich transplantierten Knochenvolumens11,12. In unserer Studie wurde beobachtet, dass Tiere, denen lebensfähige kryokonservierte menschliche Knochenchips (VC-HBG) transplantiert wurden, sowohl im 4- als auch im 8-wöchigen Zeitintervall einen signifikant größeren Anstieg des Knochenvolumens zeigten als Tiere, die A-HBG erhielten .

Die Knochenmineraldichte (BMD) hat sich in der Kontrollgruppe deutlich verändert, während in der Testgruppe die Stabilität erhalten blieb. Obwohl die VC-HBG-Transplantate im Vergleich zu den A-HBG-Transplantaten im 4-Wochen-Intervall niedrigere Werte aufwiesen, nahm die BMD der A-HBG-Gruppe nach 8 Wochen deutlich ab und wies eine geringere Dichte auf als die VC-HBG-Gruppe. Da Knochentransplantate durch schleichenden Ersatz in die Empfängerstelle integriert werden, ist zu erwarten, dass die Resorption dieser Transplantate erfolgt, gefolgt von Osteoidablagerung und späterer Mineralisierung13,14. Daher gehen wir davon aus, dass der Gehalt an lebensfähigen Zellen der VC-HBG-Gruppe möglicherweise zu einem schnelleren Knochenumsatz beigetragen hat, wodurch die Menge an Mineralmaterial durch erhöhte osteoklastische Aktivität verringert und folglich die BMD verringert und stabilisiert wurde. Für die A-HBG-Gruppe könnte der höhere BMD nach 4 Wochen durch eine langsamere Transplantatresorption und damit einen höheren Mineralstoffgehalt erklärt werden. Auch wenn dies nicht direkt getestet wurde, bestätigen die immunhistochemischen Daten zur TRAP-Zellzahl (die eine höhere Osteoklastenaktivität in der VC-HBG-Gruppe zeigt) und zur Menge der Transplantatreste bei der Histomorphometrie (mehr Transplantatreste in der Kontrollgruppe) diese Hypothese. Die meisten Studien, in denen verschiedene Arten von Knochengerüsten verglichen wurden, die mit Zellen unterschiedlicher Herkunft besiedelt waren, ergaben, dass das Verhältnis von Knochenoberfläche zu Volumen (BS/VR) in den Zellgruppen höher war als in den Kontrollgruppen15,16,17. Andererseits zeigten die Daten aus der vorliegenden Studie, dass die A-HBG-Gruppe nach 4 Wochen einen signifikant höheren BS/VR aufwies als die VC-HBG-Gruppe und nach 8 Wochen keinen statistischen Unterschied zwischen den Gruppen. Ein ähnlicher Prozess, der für die BMD gefunden wurde, könnte zu einer Verringerung der Knochenoberfläche geführt haben, was zu einer Senkung des BS/VR nach 4 Wochen und zu vergleichbaren Verhältnissen für beide Gruppen nach 8 Wochen geführt hätte. Aus dieser Perspektive bestünde der Hauptvorteil des lebensfähigen Zellinhalts darin, den Transplantataustausch und den Knochenreifungsprozess zu beschleunigen, auch wenn es im Laufe der Zeit keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen geben würde. Diese Funktion könnte praktisch sein, wenn sie auf klinische Umgebungen übertragen wird, da sie die Einheilzeit vor dem Einsetzen von Zahnimplantaten verkürzt. Es ist wichtig zu betonen, dass die Mikro-CT-Beurteilung in Verbindung mit Histologie, Histomorphometrie und Immunhistochemie analysiert werden sollte, um die Ergebnisse zu interpretieren. Somit können höhere BMD- und BS/VR-Werte, die in der A-HBG-Gruppe beobachtet wurden, mit den histologischen Abschnitten korreliert werden, in denen nach 4 Wochen eine hohe Menge an Transplantatresten beobachtet wurde18.

Histomorphometrisch zeigte die VC-HBG-Gruppe in beiden Zeitintervallen höhere Werte an neugebildetem Knochen, was mit unseren Mikro-CT-Ergebnissen übereinstimmt. In unserer vorherigen Studie10 war der Prozentsatz neu gebildeten Knochens in der zellularisierten Gruppe nach 4 Wochen höher als in der azellulären Gruppe, zeigte jedoch nach 8 Wochen keinen statistischen Unterschied. In der vorliegenden Studie wurde bei der VC-HBG-Gruppe nach 8 Wochen eine höhere Knochenneubildung beobachtet als bei der A-HBG-Gruppe. Chamieh et al.15 berichteten auch, dass der Prozentsatz neu gebildeten Knochens an den Tagen 14, 21, 28 und 35 nach der Transplantation bei Verwendung von Gerüsten, die mit MSCs aus der Zahnpulpa von Ratten besät waren, im Vergleich zu azellulären Gerüsten und mit nicht transplantierten Defekten signifikant höher war. Wofford et al.19 zeigen auch eine stärkere Knochenbildung bei Oberkieferdefekten von Mäusen, die über einen Zeitraum von 4 Wochen mit Gelfoam® und menschlichen MSCs aus Fettgewebe behandelt wurden, im Vergleich zu einer Gruppe, die nur mit Gelfoam® behandelt wurde. Nach 12 Wochen fanden sie keinen statistischen Unterschied, was auf eine verstärkte und frühe Knochenheilung in Gegenwart von MSCs aus menschlichem Fettgewebe hindeutet. Anders als in unserer vorherigen Studie10 gab es nach 4 Wochen keinen statistischen Unterschied im Prozentsatz der verbleibenden Transplantatpartikel zwischen den Gruppen. In diesem Zeitraum wiesen beide Gruppen eine größere Menge an Transplantatresten auf als nach 8 Wochen, was zu erwarten ist, da die Transplantatpartikel im Laufe der Zeit durch neuen Knochen ersetzt werden sollten. Nach 8 Wochen wies die VC-HBG-Gruppe einen deutlich geringeren Prozentsatz an Transplantatresten auf als die A-HBG-Gruppe. Dieses Ergebnis trug zum Verständnis des Vergleichs der Parameter BMD, BS/VS und Prozentsatz der Knochenreste bei: Die Testgruppe zeigte nach 8 Wochen trotz weniger verbleibender Partikel ein größeres Knochenvolumen und eine größere BMD, was zeigt, dass sie größer war Knochenbildung in dieser Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe nach 8 Wochen.

Kollagen Typ I wird hauptsächlich von Osteoblasten exprimiert und stellt einen wichtigen organischen Bestandteil der Alveolarknochenmatrix20 dar und spielt eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion des Knochengewebes21. Die Expression von Kollagen Typ I kann als Marker für die frühe Knochenbildung angesehen werden22. In unserer Studie war die COL I-Expression zu beiden Zeitpunkten in der VC-HBG-Gruppe höher als in der A-HBG-Gruppe. Der größte Unterschied wurde nach 4 Wochen beobachtet, was zeigt, dass das Vorhandensein von Zellen in den Transplantaten zu einem schnellen Anstieg der Ablagerung der extrazellulären Knochenmatrix beitrug. Dieser Befund steht im Einklang mit den Befunden von Chamieh et al.15, die die In-situ-Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer spezifischen Sonde für Col1a1 verwendeten und eine starke Kollagenexpression in Gerüsten fanden, die mit MSCs aus der Zahnpulpa von Ratten besiedelt waren, während nur schwache Signale damit verbunden waren Col1a1 wurde in azellulären Gerüsten beobachtet. Osteocalcin (OCN) gilt als eines der am häufigsten vorkommenden nicht-kollagenen Proteine, da es in erheblichen Mengen in der Knochenmatrix abgelagert wird. Es wird überwiegend von reifen Osteoblasten, hypertrophierten Chondrozyten und Odontoblasten synthetisiert und abgesondert, hat eine Affinität zu Kalzium und spielt eine wichtige Rolle bei der Knochenneubildung und -mineralisierung23,24. Die genaue Rolle dieses Proteins beim Knochenumbau ist nicht vollständig geklärt, obwohl seine Struktur auf eine Wechselwirkung mit Kalzium- und Hydroxylapatitkristallen hinweist. Aufgrund seiner Wirkung auf Osteoblasten scheint es jedoch ein wichtiger Weg zur Aktivierung der Knochenbildung zu sein. Das Auftreten und der Anstieg der Osteocalcin-Produktion fallen mit dem Beginn des Mineralisierungsprozesses zusammen25,26. In unserer Studie wurde nach 4 Wochen kein signifikanter Unterschied in der OCN-Expression festgestellt. Nach 8 Wochen zeigte die VC-HBG-Gruppe eine höhere OCN-Expression. Dieses Ergebnis unterschied sich von dem, was in unserer vorherigen Studie gefunden wurde10, die eine größere Anzahl OCN-positiver Zellen in der VC-HBG-Gruppe im 4-Wochen-Intervall und keinen statistischen Unterschied nach 8 Wochen zeigte. Da die OCN-Expression ein Marker für die späte Knochenbildung ist, die während des Mineralisierungsprozesses involviert ist22,23,24,25, könnte dies eine Erklärung für die erst nach 8 Wochen beobachtete höhere Expression sein. Eine ähnliche Beobachtung machten Tera et al.27 in einer Studie mit ovarektomierten Ratten, die ein autogenes Knochentransplantat erhielten. Während der anfänglichen Kristallbildung wurde keine OCN-Färbung beobachtet, sie konnte jedoch in den späteren Stadien der Knochenbildung gefunden werden, wobei Osteoblasten und neu gebildete Knochenmatrix am Tag 45 und Tag 60 positiv waren, was die Merkmale von reifem Knochen offenbarte. De Ponte et al.28 beobachteten auch immunpositive Zellen für OCN erst nach 6 Monaten Transplantation der Kieferhöhlenerhöhung mit frisch gefrorenem azellulärem Knochen beim Menschen. Im Knochen wird Osteopontin (OPN) von Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten synthetisiert und sezerniert29. Es handelt sich um ein multifunktionales Matrixprotein, das an der Regulierung der physiologischen und pathologischen Mineralisierung beteiligt ist. OPN dient sowohl der Vereinigung der Knochenzellen mit der Matrix als auch der Erzeugung intrazellulärer Signale, die für die normale Beweglichkeit der Osteoklasten im Knochen unerlässlich sind30. Es wird von Osteoblastenzellen in verschiedenen Stadien produziert und es wurde vermutet, dass seine Expression in zwei Spitzen erfolgt31. Daher ist dieses Protein in Knochenmarksstammzellen mit mittleren Expressionsniveaus in den ersten Differenzierungsstadien während der Proliferation von Zellvorläufern wie Präosteoblasten und in hohen Expressionsniveaus in Osteoblasten nachweisbar32. In der vorliegenden Studie war die OPN-Expression in beiden Zeitintervallen in der VC-HBG-Gruppe höher als in der A-HBG-Gruppe. Wofford et al.19 zeigten in Woche 4 eine bemerkenswerte Expression von OPN bei Mäusen mit Proben, die mit Gelfoam® plus menschlichen MSCs aus Fettgewebe behandelt wurden, die eine organisiertere morphologische Verteilung dieses Proteins im Vergleich zum chaotischen Muster in Gelfoam®-Proben ohne Zellen zeigten. Unsere Studie zeigte eine höhere Expression von Proteinen, die an der Osteogenese beteiligt sind (OCN, OPN und COL I), in der VC-HBG-Gruppe im Vergleich zur A-HBG-Gruppe, was darauf hindeutet, dass der Prozess der Mineralisierung und Knochenbildung bei Knochentransplantaten zunimmt Zellen, was unsere vorherige Studie bestätigt10.

Tartratresistente saure Phosphatase ist ein Enzym, das in Osteoklasten und Erythrozyten vorkommt und bei der Knochenresorption freigesetzt wird, wodurch der Abbau der organischen Matrix gefördert wird. Es gilt als wichtiger Marker der osteoklastischen Aktivität33. In der vorliegenden Arbeit zeigte die VC-HBG-Gruppe zu beiden Zeitpunkten eine höhere TRAP-Expression, im Gegensatz zu unseren früheren Ergebnissen mit Zelltransplantaten10, bei denen es erst nach 4 Wochen eine größere Positivität für TRAP gab. Der Nachweis von TRAP-positiven Osteoklasten, die auch auf der Oberfläche neu gebildeter Knochen gefunden wurden, weist auf einen frühen Prozess des laufenden Umbaus hin, der in der Gruppe mit VC-HBG stärker ausgeprägt war und in dieser Studie bis zum Zeitintervall von 8 Wochen anhielt.

Dies ist die erste Studie, die die überlegenen Vorteile lebensfähiger kryokonservierter menschlicher Knochentransplantate (VC-HBG) für die Unterkieferaugmentation zeigt. Das verwendete Tiermodell bringt jedoch methodische Einschränkungen mit sich. Athymische Ratten vertrugen die Implantation menschlicher Zellen und Knochenfragmente gut, ohne nachteilige oder immunologische Reaktionen zu zeigen. Dennoch muss das transplantierte Material in dieser Studie als xenogenes Transplantat betrachtet werden, anders als wir es im Kontext einer klinischen Verwendung am Menschen erwarten würden. Darüber hinaus war es nicht möglich, die chronologische Entwicklung der Eingliederungs- und Umbauprozesse bei demselben Individuum genau zu bestimmen, da zur Beurteilung der Parameter zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Tiere verwendet werden mussten. Letztendlich konnten wir die Überlegenheit des VC-HBG für seinen Endzweck, nämlich die Platzierung von Zahnimplantaten, nicht testen. Daher besteht künftiger Forschungsbedarf zum Verhalten der verheilten Transplantate bei Vorhandensein von Implantaten. Trotz dieser Einschränkungen zeigten die Ergebnisse dieser experimentellen Forschung, dass das VC-HBG im Vergleich zum A-HBG positive osteogene Eigenschaften, eine stärkere Knochenbildung, eine höhere Rate des Knochenumbaus und eine bessere Gesamtintegration in den Unterkiefer von Ratten aufweist. Zukünftige Studien an größeren Tieren mit anschließender Platzierung von Zahnimplantaten und klinische Studien am Menschen sind erforderlich, um die Machbarkeit und die langfristigen Ergebnisse der Verwendung von VC-HBG im Dentalbereich zu bewerten.

Fragmente frischer menschlicher Wirbel aus der Gewebebank der University of Miami wurden von Leichenspendern entnommen und in einem manuellen Knochenbrecher zerkleinert, um Knochensplitter optisch einheitlicher Größe herzustellen. Anschließend wurden die Knochensplitter gründlich mit Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) gewaschen und gefriergetrocknet, um jeglichen lebensfähigen Zellinhalt zu entfernen. Zum Zeitpunkt der Verwendung wurde VC-HBG nach dem Auftauen mit DPBS gewaschen. A-HBG wurde vor der Verwendung mit DPBS hydratisiert. Die makromorphologische Konsistenz, Textur und das Aussehen beider Materialien waren nach der Herstellung nicht zu unterscheiden. Die Partikelgröße lag für beide Gruppen zwischen 250 und 1000 µm.

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami genehmigt und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Vorschriften, einschließlich der ARRIVE-Richtlinien, durchgeführt. In dieser Studie wurden zwanzig athymische Nacktratten (NTac: NIH-Foxn1rnu, weiblich, 10 Wochen alt, 150–200 g schwer) verwendet. Die Leistungsanalyse und die Berechnung der Stichprobengröße wurden mit der Software G*Power 3.0 durchgeführt. Die Analyse der Stichprobenstärke unter Verwendung eines einfaktoriellen ANOVA-Versuchsdesigns mit 4 unabhängigen Gruppen mit α = 0,05, einem Effekt von 0,85 und einer Stichprobengröße von 20 Tieren (für alle Gruppen) führt zu einer Trennschärfe von > 0,80. Die Tiere wurden zufällig in 2 verschiedene Gruppen mit jeweils 10 Individuen und jeweils 2 Zeitintervallen eingeteilt (n = 5 Tiere pro „Zeitpunkt“). Alle Operationen wurden von demselben erfahrenen Kieferchirurgen (Daniel Deluiz) durchgeführt, wie zuvor beschrieben10. Die Ratten wurden mit Isofluran betäubt und dann auf ein 37 °C warmes Heizkissen gelegt. Puralube® Vet Ointment wurde auf die Augen aufgetragen, um ein Austrocknen zu verhindern. Im submandibulären Bereich wurde eine Antisepsis mit topischem Polyvinylpyrrolidon-Jod durchgeführt. Der submandibuläre chirurgische Ansatz wurde durch einen linearen Schnitt durchgeführt, der die Haut- und Unterhautschichten umfasste und den Kaumuskel freilegte. Der Muskel wurde entlang der submandibulären Grenze eingeschnitten, wobei darauf geachtet wurde, den Gesichtsnerv nicht zu verletzen. Ein Lappen, der den Muskel und das Periost umfasste, wurde angehoben, wodurch die seitliche Seite des Unterkiefers der Ratte freigelegt wurde, wodurch ein Beutel unter dem Kaumuskel entstand. Das Wirtsbett wurde intakt gehalten, um Brüche oder unzureichenden Knochen zur Stabilisierung der Titanschraube zu vermeiden. Eine 4,0 mm lange Titan-Mikroschraube mit 1,5 mm Durchmesser (KLS Martin, Tuttlingen, Deutschland) wurde an der lateralen Seite des Unterkiefers befestigt, um den Platz aufrechtzuerhalten und das Transplantat mithilfe der Tent-Pole-Technik zu stabilisieren34. Das Material (VC-HBG oder A-HBG) wurde dann um die Schraube herum und auf dieser platziert. Die Materialmenge (0,1 cm³) wurde so gewählt, dass sie den Hohlraum zwischen dem Knochen und dem erhöhten Muskel vollständig ausfüllt, und wurde dann mit einer resorbierbaren Fruchtwassermembran abgedeckt, um die Stabilität des Materials an Ort und Stelle aufrechtzuerhalten. Frühere experimentelle Operationen wurden an Tieren durchgeführt, die nicht in die Studie einbezogen wurden, um die Strategie und Standardisierung der Materialanwendung festzulegen. Der Wundverschluss erfolgte auf der Muskel- und Hautebene mit Vicryl 5–0-Nähten. Die durchschnittliche Dauer des Eingriffs und der Anästhesie betrug für jedes Tier 15 Minuten. Die Antibiotikatherapie erfolgte mit einer Einzeldosis Gentamicin (5,0 mg/kg i.m.) und Buprenorphin (0,1 mg/kg s.c.) wurde einmal vor der Operation und 3 Tage danach zur Schmerzkontrolle verabreicht. Die Ratten erhielten postoperativ drei Tage lang eine weiche Diät und wurden dann wieder auf das Standard-Trockenfutterprogramm umgestellt. Wasser wurde nach Belieben bereitgestellt.

Die Tiere wurden nach 4 und 8 Wochen durch CO2-Inhalation eingeschläfert und vor dem Scannen mit dem Mikro-CT-Gerät (SkyScan 1176, Bruker, Kontich, Belgien) enthauptet. Jedem Kopf/jeder Probe wurde eine Referenznummer zugewiesen, um den Prüfer für die Analysen blind zu machen. Die Bildgebungsparameter waren: 1 mm Aluminiumfilter, Belichtung von 71 ms, 65 kV, 385 µA, 18 µm Pixelgröße und 0,70° Rotationsschritt. Die Bilder wurden mit der NRecon-Software (Bruker) mit 30 % Strahlaufhärtungskorrektur rekonstruiert. Die Analysen wurden blind vom gleichen Prüfer durchgeführt und zeigten einen Intra-Untersucher-Reproduzierbarkeits-Kappa-Index von 0,90. Alle Datensätze wurden mit der DataViewer-Software (Bruker) auf die gleiche Ausrichtung ausgerichtet (laterale Seite des Unterkiefers horizontal und Titanschraube vertikal ausgerichtet). Auf den rekonstruierten Bildern wurde mit dem CTAnalyser ein interessierender Bereich (ROI1) ausgewählt, der den gesamten transplantierten Bereich (homogene verkalkte Formation um die Titanschraube herum plus verteilte Mikropartikel aufgrund von überschüssigem Material) umfasst und den Unterkiefer der Ratte (und die Titanschraube) ausschließt Software (Bruker). Um die Analyse des überschüssigen Materials zu vermeiden, das nicht an der Knochenaugmentation beteiligt war, wurde eine neue Region innerhalb von ROI1 ausgewählt – ROI2. Der ROI2 wurde auf standardisierte Weise für alle Proben unter Verwendung eines Schwellenwerts von Hounsfield-Einheiten (zwischen + 200 und + 2000 HU) definiert. Dieser Schwellenwert umfasste den optisch verpflanzten Bereich (homogene verkalkte Formation um die Titanschraube) und schloss die überschüssigen Partikel (und die Schraube) aus den Messungen aus. Die im ROI2 bewerteten Parameter waren: gewonnenes Knochenvolumen (BV), Knochenmineraldichte (BMD), prozentuales Knochenvolumen (PBV), Verhältnis von Knochenoberfläche zu Volumen (BS/VR) und Knochenoberflächendichte (BSD).

Unmittelbar nach der Mikro-CT-Scan-Analyse wurden die Mandibeln zusammen mit dem umgebenden Gewebe chirurgisch entfernt und eine Woche lang mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Titanschrauben wurden entfernt, wobei darauf zu achten war, dass die transplantierten Bereiche nicht beschädigt wurden. Die Proben wurden 3 Tage lang mit Cal-Ex-Entkalkungslösung (Fisher Scientific, Massachusetts, USA) entkalkt, in destilliertem Wasser gespült, in Alkohol dehydriert, in Xylol geklärt und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden Paraffinblockproben in 3 µm dicke Scheiben geschnitten und anschließend zur histologischen und histomorphometrischen Auswertung mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse 90i Lichtmikroskop aufgenommen.

Die histomorphometrische Auswertung wurde von einem verblindeten einzelnen geschulten Untersucher anhand von 4 Bildern von jeder Probe (ausreichend, um den gesamten transplantierten Bereich abzudecken) bei 10-facher Vergrößerung unter Verwendung der ImageJ (NIH)-Software durchgeführt. Der Prüfer war zuvor auf Reproduzierbarkeit innerhalb des Prüfers getestet worden und hatte einen Kappa-Index von 0,80. Neu gebildeter Knochen sowie nicht eingegliederte Transplantatpartikel wurden auf den Bildern visuell identifiziert und mit dem Auswahltool der Software markiert. Fehler bei der automatischen Auswahl wurden manuell überprüft und korrigiert. Die definierten Bereiche mit neuem Knochen wurden dann blau eingefärbt, während Bereiche mit nicht eingegliederten Transplantatresten rot eingefärbt wurden. Durch die farbliche Kennzeichnung konnten die Auswahlen leichter unterschieden werden. Die Menge jedes Parameters wurde als Prozentsatz der gesamten Bildoberfläche berechnet.

Immunhistochemische Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden primären Antikörper durchgeführt, um die Knochenbildung und den Knochenumbau zu beurteilen: Anti-OCN (Osteocalcin, Klon: ab10911, Millipore, Massachusetts, USA, 1:200-Verdünnung), Anti-OPN (Osteopontin, Klon: Akm2A1, Santa Cruz). Biotechnology, Inc, 1:100 Verdünnung), Anti-COL 1 (Kollagen Typ 1, Klon: ab90395, Abcam, Massachusetts, USA, 1:100 Verdünnung) und Anti-TRAP (tartratresistente saure Phosphatase, Klon: EPR15556, Abcam, Massachusetts, USA, 1:200 Verdünnung). Die Schnitte wurden zunächst in Xylol entparaffiniert, in abnehmenden Konzentrationen an absolutem Alkohol (90°, 70°) hydratisiert und einer Antigengewinnung unter Verwendung einer gepufferten Natriumcitratlösung (10 nM, pH 6,0) in einem Wasserbad bei 90 °C für 20 Minuten unterzogen. Die Inaktivierung der endogenen Peroxidase erfolgte durch 10-minütiges Eintauchen der Schnitte in 3 % Wasserstoffperoxid und anschließende 60-minütige Inkubation mit Primärantikörpern in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Gemäß den Richtlinien des Herstellers wurden in allen Reaktionen positive und negative Kontrollen (Weglassen der Primärantikörper) einbezogen. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Schnitte mit den sekundären Antikörpern unter Verwendung eines biotinfreien immunoenzymatischen Antigen-Nachweissystems inkubiert und mit einem Diaminobenzidin-Chromogen aus demselben System nachgewiesen (Reveal Polyvalent HRP-DAB-Nachweissystem, Kat.-Nr. SPD-125, Spring). Biowissenschaften, Kalifornien, Vereinigte Staaten). Die Proben wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Mittels Lichtmikroskopie wurden 10 Sichtfelder (FOV) jedes Objektträgers (die den gesamten transplantierten Bereich abdecken) bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen, um die Anzahl der TRAP-positiven Zellen zu quantifizieren. Die Zellen wurden innerhalb der Fläche jedes FOV gezählt und die mittlere Anzahl wurde für die entsprechende Probe berechnet (die Zellzahl jeder Probe ist ein Ergebnis des Mittelwerts ihrer FOVs). Die mittlere Zellzahl für jede Gruppe wurde zwischen den Gruppen verglichen12. Für die OCN-, OPN- und COL1-Quantifizierung wurden 4 Bilder von jeder Probe bei 10-facher Vergrößerung mit der ImageJ-Software (NIH) analysiert. Der positive Reaktionsbereich wurde mit dem Tool „Schwellenwertfarbe“ ausgewählt und von der Software in Pixeln berechnet. Der Positivitätsschwellenwert wurde von zwei verschiedenen verblindeten Bewertern visuell in Übereinstimmung bestimmt und zur Bewertung aller Proben wurde derselbe Wertebereich verwendet.

Die statistische Analyse wurde mit SPSS (IBM Analytics) durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf 5 % (p < 0,05) festgelegt. Der Student-T-Test unabhängiger Proben wurde durchgeführt, um den Unterschied in den untersuchten Variablen zwischen den beiden Transplantattypen (A-HBG und VC-HBG) nach 4 Wochen und 8 Wochen zu überprüfen. Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde verwendet, um die Nichtablehnung der Annahme der Normalität der Verteilung zu überprüfen, daher wurde ein parametrischer Test verwendet. Die Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Auswirkung der Art des Transplantats und die Auswirkung der Zeit sowie die Wechselwirkung zwischen ihnen bei allen untersuchten Variablen zu bewerten. Um die Annahmen der Analyse zu überprüfen, wurde die Verteilung der standardisierten Fehler zusätzlich zur Auswertung des Normal-Q-Q-Diagramms mithilfe des Kolmogorov-Smirnov- (mit Lilliefors-Korrektur) und des Shapiro-Wilk-Normalitätstests bewertet. Nach der Analyse der Residuen gab es keine signifikante Ablehnung der Annahme einer Normalität der Datenverteilung durch irgendeine Variable der Studie, was den verwendeten parametrischen Test bestätigte.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde vom Miami VA Healthcare System Geriatric Research Education and Clinical Center unter Nutzung der Ressourcen und Einrichtungen von VINCI, VA HSR RES 13-457, unterstützt. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht die des Geriatric Research Education and Clinical Center oder VINCI. Die Transplantatmaterialien wurden von Vivex Biomedical, Inc. bereitgestellt. DD erhielt ein Postdoktorandenstipendium vom brasilianischen Nationalen Rat für technologische und wissenschaftliche Entwicklung (CNPq).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Daniel Deluiz und Gaëtan J.-R. Delcroix.

Abteilung für Parodontologie, Staatliche Universität Rio de Janeiro, Boulevard 28 de Setembro, 157 – 2. Stock – Raum 10, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20551-030, Brasilien

Daniel Deluiz, Samira RG Fraga und Edward MB Tinoco

Abteilung für Orthopädie, University of Miami, Miami, FL, USA

Daniel Deluiz

College of Allopathic Medicine, Nova Southeastern University, Fort Lauderdale, FL, USA

Gaëtan J.-R. Delcroix

Geriatrische Forschungsausbildung und klinisches Zentrum, Miami VA Healthcare System, Miami, FL, USA

Gaëtan J.-R. Delcroix, Cristina Grau-Monge, Andrea Bonnin-Marquez, Teresita Reiner und Paul Christian Schiller

Abteilung für Biomedizintechnik, College of Engineering, University of Miami, Miami, FL, USA

Gianluca D'Ippolito

Abteilung für Pathologie und Labore, Staatliche Universität Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasilien

Thais Amadeu

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DD entwarf die Studie, führte die Tieroperationen durch, sammelte die Proben und verfasste das Manuskript, GJD führte die Dateninterpretation durch, bereitete die Bilder vor und verfasste das Manuskript, SRGF führte die Probenvorbereitung, mikroskopische Analysen und statistische Auswertungen durch, GD entwickelte und bereitete das zellularisierte Transplantat vor CGM leistete die Unterstützung für die Operationen und die Tierpflege, führte die Bildaufnahme und die uCT-Probenvorbereitung durch, ABM führte die Bildaufnahme und die uCT-Probenvorbereitung durch, TR und TA führten die histologische Probenvorbereitung und Interpretation der histologischen/immunhistochemischen Daten durch, PCS und EMBT koordinierten die Studie . Alle Autoren haben das endgültig eingereichte Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Daniel Deluiz oder Paul Christian Schiller.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Deluiz, D., Delcroix, G.JR., Fraga, SRG et al. Lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat weist überlegene osteogene Eigenschaften bei der lateralen Augmentation des Unterkiefers auf. Sci Rep 13, 1422 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28170-6

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Eingegangen: 28. Oktober 2022

Angenommen: 13. Januar 2023

Veröffentlicht: 25. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28170-6

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Lebensfähiges kryokonserviertes menschliches Knochentransplantat weist überlegene osteogene Eigenschaften bei der lateralen Augmentation des Unterkiefers auf