Messung von Kopf- und Halstumoren von Mäusen durch automatisierte Analyse von DVT-Bildern

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12033 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Tierversuche werden oft verwendet, um die Auswirkungen von Medikamenten und anderen biologischen Bedingungen auf das Fortschreiten von Krebs zu bestimmen, aber die schlechte Genauigkeit und Reproduzierbarkeit etablierter Methoden zur Tumormessung machen die Ergebnisse unzuverlässig. In orthotopen Mausmodellen für Kopf- und Halskrebs werden herkömmlicherweise Tumorvolumina, die durch Dickenmessungen angenähert werden, zum Vergleich von Gruppen verwendet, aber geometrische Herausforderungen machen das Verfahren ungenau. Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine Software entwickelt, um diese Tumore durch automatisierte Analyse von Kegelstrahl-Computertomographie-Scans (CBCT) besser zu messen. Dies ermöglicht Analysen der Tumorform und Wachstumsdynamik, die sonst zu ungenau wären, um biologische Erkenntnisse zu liefern. Bei der parallelen Überwachung des Tumorwachstums mithilfe von Messschiebern und Bildgebung stellen wir fest, dass die Messschiebermessungen kleiner Tumoren nur schwach mit dem tatsächlichen Tumorvolumen korrelieren und sehr anfällig für eine Verzerrung durch den Experimentator sind. Die vorgestellte Methode bietet ein einzigartiges Fenster zu Fehlerquellen in einem grundlegenden Aspekt der präklinischen Kopf- und Halskrebsforschung und ein wertvolles Instrument zu deren Eindämmung.

Trotz der Fortschritte bei der Verwendung von Organoiden1 und Organ-on-Chip-Technologien2 können In-vitro-Systeme entscheidende Aspekte echter Tumoren nicht reproduzieren, die eine vielfältige Reihe von Stromazellen enthalten, mit einem systemischen Immunsystem interagieren und in entfernte Organe metastasieren können . Mausmodelle für Krebs überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen kontrollierte Experimente, in denen Gruppen nahezu identischer Tiere mit pharmakologischen und genetischen Manipulationen verglichen werden, um präzise biologische Hypothesen zu testen. Sie sind daher von immensem Wert, wenn es darum geht zu zeigen, dass etwas das Tumorwachstum beeinflusst – oder um herauszufinden, warum, in einem Kontext, in dem der Effekt direkt überprüft werden kann.

Leider sind die zur Messung von Tumoren bei Mäusen verwendeten Methoden oft ungenau, zeitaufwändig und anfällig für verschiedene Formen von Verzerrungen. Das Volumen eines äußerlich tastbaren Tumors wird normalerweise mithilfe der folgenden Formel (oder einer ähnlichen Formel) anhand der mit einem Messschieber gemessenen Entfernungen geschätzt:

Dabei sind dlong und dshort die längere bzw. kürzere von zwei ungefähr orthogonalen Messungen. Details des Messverfahrens, einschließlich der Art und Weise, wie die Messschieber fest zusammengedrückt werden, tragen wahrscheinlich zu zufälligen Fehlern und Inkonsistenzen zwischen den Messgeräten bei. Das Ausmaß, in dem Gl. (1) Ob das Volumen über- oder unterschätzt wird, hängt natürlich auch von der Tumorform ab. Dies gilt insbesondere für Kopf- und Halskrebs (HNC), bei dem Tumore exophytisch oder endophytisch durch die Foramen wachsen und in benachbarte Lymphknoten eindringen können.

Das Wachstum von Tumoren, die von außen nicht tastbar sind, wie etwa Lungentumoren3 oder Hirntumoren4, kann stattdessen mithilfe medizinischer Bildgebungsmodalitäten verfolgt werden, einschließlich Computertomographie (CT)5, Magnetresonanztomographie (MRT)6 und Ultraschall. Obwohl dies nützliche Informationen liefern kann, ist die Anwendbarkeit der bildbasierten Tumormessung zur seriellen Überwachung mehrerer Tiere durch lange Bildaufnahme- und Analysezeiten begrenzt. Es wurde bereits berichtet, dass die Messung mit der Schieblehre weniger genau ist als die bildbasierte Messung derselben Tumoren7,8. Die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ist in diesem Zusammenhang auch als Methode zum Vergleich des Wachstums von entsprechend markierten Tumoren bemerkenswert, obwohl sie mit einer Reihe technischer Probleme behaftet ist9,10 und normalerweise nicht zur Schätzung des Tumorvolumens verwendet wird11.

Messungen des Tumorvolumens sowohl mit Messschiebern als auch mit manueller Bildanalyse, allein durch die direkte Beteiligung von Menschen, ermöglichen auch eine bewusste oder unbewusste Verzerrung der Ergebnisse. Trotz der Belege für solche Experimentiereffekte und der Bedeutung der blinden Datenaufzeichnung12,13 ist dies in diesem Zusammenhang keine gängige Praxis und stellt einen wichtigen Vorteil der Automatisierung der Tumorvolumenquantifizierung dar.

Wir haben daher versucht, eine genaue Methode zur Tumormessung durch automatisierte Bildanalyse zu entwickeln, die diese Fehlerquellen überwindet und gleichzeitig ausreichend kostengünstig ist, um als direkten Ersatz eine kontinuierliche Überwachung des Tumorwachstums bei vielen Tieren im Verlauf eines Experiments zu ermöglichen zur Dickenmessung. Zu diesem Zweck haben wir eine Software entwickelt, die Bilder der niedrig dosierten Kegelstrahl-Computertomographie (CBCT) von bis zu fünf Mäusen mit bukkalen Tumoren verarbeitet, die einzelnen Mäuse isoliert und die Bilder segmentiert, um Volumina und zusätzliche Informationen zu jedem Tumor zu berechnen, ohne dass dies erforderlich ist jegliche Benutzereingabe. Wir präsentieren eine vorläufige Analyse der von dieser Software generierten Daten und Dickenmessungen zum Vergleich.

Obwohl immer noch erhebliche Hindernisse für den weit verbreiteten Einsatz der CBCT zur Überwachung des Tumorwachstums bestehen, hoffen wir, zeigen zu können, dass die Entwicklung von Technologien zu ihrer Erleichterung einen großen potenziellen Nutzen für die HNC-Forschung hat. Es ist auch wichtig anzuerkennen, dass sich die hier beschriebenen Methoden und Ergebnisse auf spezifische Herausforderungen bei der Messung von bukkalen Tumoren bei Mäusen beziehen, die für Tumoren an anderen Standorten möglicherweise nicht relevant sind. Da wir außerdem nicht über eine Goldstandard-Messmethode verfügen, mit der wir die Ergebnisse vergleichen könnten, können wir die Genauigkeit unserer Methode nicht effektiv als physikalische Messung validieren. Diese Ergebnisse sollen eine detaillierte Beschreibung der Einschränkungen der Dickenmessung, insbesondere von bukkalen Tumoren bei Mäusen, liefern und Anwendungen der automatisierten CT-Segmentierung zur Tumorform- und Wachstumsratenanalyse untersuchen, zwei Bereiche, die unserer Meinung nach erheblich von dieser Art von Software profitieren .

Die Kegelstrahl-Computertomographie (CBCT), eine Form der CT-Bildgebung, die häufig in der Zahnmedizin und Strahlentherapie eingesetzt wird, ist in der Lage, schnell 3D-Bilder mit hoher Auflösung in allen drei Dimensionen zu erfassen, was für eine genaue Volumenmessung wünschenswert ist. Als Machbarkeitsnachweis für die Verwendung unserer CBCT-Bilder zur Volumenmessung haben wir eine Sammlung kleiner Aliquotröhrchen mit bekannten Wasservolumina gescannt und ein Python-Skript zum Segmentieren des Bildes verwendet (ergänzende Abbildung S1A, B). Die aus der Anzahl der Voxel in jeder als Wasser identifizierten Region berechneten Volumina stimmten sehr gut mit den Volumina überein, die auf der Grundlage des Wiegens des Wassers beim Pipettieren in die Röhrchen erwartet wurden (ergänzende Abbildung S1C). In diesem Fall wurde die Bildsegmentierung durch Schwellenwertbildung (Voxelwerte in Wasser sind höher als in Luft oder Kunststoff), eine gewisse Verarbeitung des Binärbilds zur Korrektur der Auswirkungen von Rauschen und Graten und die Trennung der Voxel der Wasserdichte in verbundene Komponenten erreicht. Während ähnliche Methoden auch auf Mäuse anwendbar sind, sind Tumore in CT-Bildern nicht leicht von anderem Weichgewebe zu unterscheiden, sodass für ihre Segmentierung ein etwas komplizierter Ansatz erforderlich war (Abb. 1a).

Überwachung des bukkalen Tumorwachstums durch automatische CT-Analyse. (a) Konzeptionelles Blockdiagramm des automatischen CT-Analyseprogramms. (b) Abbildungen der Anordnung zum Scannen mit mehreren Mäusen. (c) Automatische Aufteilung von Multi-Maus-Scans. Die gelbe gestrichelte Linie stellt die Anzahl der Voxel dar, die Zähne darstellen – wie durch Schwellenwertanalyse isoliert –, die in jeder horizontalen Ebene des Scans vorhanden sind, und die roten gestrichelten Linien zeigen vertikale Teilungspunkte an, die daraus erkannt wurden. (d) Entfernen unerwünschter Objekte aus dem Scan. (e) Maximalintensitätsprojektionen eines repräsentativen Scans mit automatisch annotierten Punkten und hervorgehobenen Armen und Schädel, um die Knochensegmentierung zu demonstrieren. Abbildung (e–g) und ergänzende Abbildung S2C–G wurden während der Analyse desselben Scans erstellt. Die Achsen sind gemäß dem in der ergänzenden Abbildung S2A gezeigten Koordinatensystem beschriftet. (f) Maximalintensitätsprojektionen des Kopfes nach Neuabtastung in die symmetrische Standardausrichtung. (g) (links) anfängliche Höhenkarte des überschüssigen Gewebes auf der rechten Seite des Kopfes im Vergleich zur linken und (rechts) Höhenkarte des überschüssigen Gewebes nach der 2D-Verarbeitung. Diese Bilder sind lineare Pseudofarben und umfassen den gesamten Datenbereich. (h) Koronale (links) und axiale (rechts) Schnitte des Originalscans mit segmentierten Knochen- und Zahnregionen, die in verschiedenen Farben hervorgehoben sind, sowie dem Tumor in Dunkelgrün und (unten) 3D-Darstellung der Segmentierung, wie oben gezeigt.

Unter Verwendung modifizierter Stadien und Anästhesie-Setups (Abb. 1b, ergänzende Abb. S1D) konnten wir DVT-Scans mehrerer Mäuse mit einer Geschwindigkeit anfertigen, die mit der Messschiebermessung vergleichbar ist (ergänzende Abb. S1E, F), was dies zu einer praktikablen Alternative für Tumoren macht Überwachung im großen Maßstab. Anschließend war eine Vorverarbeitung der resultierenden Scans erforderlich, um einzelne Mäuse zu trennen (Abb. 1c) und Nicht-Maus-Objekte zu entfernen (Abb. 1d). Die von uns entwickelte Methode zur Segmentierung jeder Maus nutzt die Symmetrie des Kopfes, um Gewebe auf einer Seite zu identifizieren, das nicht dem Gewebe auf der anderen Seite entspricht. Diese Links-Rechts-Abbildung wird durch Anpassen eines krummlinigen Koordinatensystems erreicht, das sich mit dem Hals und Kiefer biegt. Im Gegensatz zum natürlichen Koordinatensystem der Voxelindizes (ergänzende Abbildung S2A), bei dem jedes Voxel das gleiche Raumvolumen darstellt, definieren die gekrümmten Koordinaten ein Gitter, in dem das von jedem Punkt dargestellte Volumen des realen Raums variiert. Um dies zu berücksichtigen, wurden Volumina im gekrümmten Raum berechnet, indem Volumina von 24 Tetraedern pro Voxel addiert wurden, die so angeordnet waren, dass der gesamte reale Raum genau einmal gezählt wurde (ergänzende Abbildung S2B).

Wir haben verschiedene Bildverarbeitungstechniken verwendet, darunter Schwellenwerte, Regionswachstum, Registrierung kleiner Voxelblöcke und Filter, um bestimmte Merkmale zu erkennen, um zuerst die Zähne (ergänzende Abbildung S2C), dann die Knochen (Abb. 1e) zu segmentieren und verschiedene konsistent zu kennzeichnen identifizierbare Punkte.

Indem wir Punkte auf der linken Seite des Körpers mit Punkten auf der rechten Seite abgleichten und zwischen ihnen interpolierten, erstellten wir dann ein krummliniges Punktegitter, an dem wir jede Maus in eine symmetrische Ausrichtung umwandeln konnten (Ergänzende Abbildung S2D – G, Abbildung 1f). , wodurch Gewebe auf der linken Seite des Kopfes auf einfache Weise auf die rechte abgebildet und subtrahiert werden kann, um Tumorwachstum zu erkennen. Anschließend wurde eine Höhenkarte des überschüssigen Gewebevolumens auf einer Seite in 2D gefiltert (Abb. 1g), um eine Tumorhöhenkarte zu erstellen, die zur Segmentierung des Tumors in den ursprünglichen 3D-Scan zurückprojiziert wurde (Abb. 1h).

Um die automatische Segmentierungssoftware zu validieren, haben wir dieselben Mäuse am selben Tag zweimal mit zufällig ausgewählten Standorten in jedem Scan gescannt, um zu bestimmen, inwieweit berechnete Tumorvolumina durch zufällige Positionierungsvariationen beeinflusst werden. Die Volumina waren zwischen zwei Drei- oder Fünf-Maus-Scans ähnlich, und die Verwendung von Fünf-Maus-Scans geringerer Qualität mit 0,2-mm-Voxeln im Vergleich zu Drei-Maus-Scans höherer Qualität mit 0,1-mm-Voxeln schien die berechneten Volumina nicht wesentlich zu verzerren ( Abb. 2a). Um die Wiederholbarkeit mit der Caliper-Methode zu vergleichen, haben wir die Volumina einer Reihe von Tumoren anhand von Caliper-Messungen durch drei verschiedene Messgeräte berechnet und am selben Tag drei Sätze von Scans derselben Mäuse aufgenommen. Das Caliper-Volumen variierte erheblich für alle Tumorgrößen.

Wiederholbarkeit von Tumorvolumenmessungen. (a) Variation zwischen Tumorvolumina, berechnet aus zwei Scans derselben Maus am selben Tag. (links) für beide Scans unter Verwendung der 5-Maus-Scananordnung (Abb. 1b) mit 0,2-mm-Voxeln oder für beide unter Verwendung der 3-Maus-Scananordnung (ergänzende Abb. S1D) und (rechts) von einem Scan jedes Typs. (b) Vergleich der von drei verschiedenen Messgeräten durchgeführten Dickenmessungen, aufgetragen gegen den Durchschnitt der Volumina, die aus drei verschiedenen Scans berechnet wurden (N = 18). Alle anderen in diesem Artikel berichteten Dickenmessungen wurden von „Measurer One“ erfasst. Beachten Sie, dass es sich bei den Feldern (c) und (d) um unterschiedliche Darstellungen derselben Daten handelt. (c) Variabilitätsvergleich zwischen den Caliper-Ergebnissen von drei Messgeräten (horizontale Balken stellen ihre Standardabweichung dar) und drei aufeinanderfolgenden CT-Segmentierungsmessungen (vertikale Balken stellen ihre Standardabweichung dar) derselben Tumoren am selben Tag. (d) Vergleich der Standardabweichungen der mit der Schieblehre gemessenen Volumina und der CT-gemessenen Volumina für verschiedene Tumorgrößen mit angepassten Linien der kleinsten Quadrate (gepunktet). (e) Vergleich der Volumina, die aus der manuellen Konturierung von kontrastverstärkten CT-Bildern mit drei verschiedenen Methoden abgeleitet wurden, zusammen mit den vom CT-Lineal berechneten Volumina (berechnet unter Verwendung von Gleichung (1) aus gemessenen Abständen, wie in der ergänzenden Abbildung S3B dargestellt) (N = 14). (f) 3D-Darstellungen von drei Arten der manuellen Segmentierung eines repräsentativen Tumors (obere Reihe) und hervorgehobener koronaler Schnitt (untere Reihe) aus der manuellen Segmentierung eines repräsentativen kontrastverstärkten CT-Scans.

Ein Messgerät zeichnete tendenziell geringere Volumina auf als die anderen, erzielte eine gute Übereinstimmung mit den Volumina aus der DVT-Segmentierung (Abb. 2b) und erfasste alle anderen in diesem Artikel berichteten Dickenmessungen. Wichtig ist, dass die Ergebnisse der Dickenmessungen weniger denen der automatischen DVT-Analyse in anderen Experimenten ähnelten (ergänzende Abbildung S3A). Unterschiede zwischen den Messgeräten sind ein erhebliches Problem bei der Messschiebermethode und führen zu offensichtlichen Inkonsistenzen, wenn eine Person nicht alle Messschiebermessungen für ein bestimmtes Experiment erfasst. Die Variabilität zwischen den Dickenmessungen eines bestimmten Tumors war tendenziell weitaus größer als die Variabilität zwischen den DVT-Segmentierungsvolumina aus verschiedenen Scans, insbesondere bei kleinen Tumoren (Abb. 2c). Es scheint, dass zufällige Fehler bei der Volumenmessung mittels CT ungefähr proportional zum Volumen sind, wohingegen ein erheblicher Teil der Variabilität zwischen Dickenmessungen unabhängig vom Volumen ist (Abb. 2d).

In ähnlicher Weise haben wir die Ergebnisse der automatischen Segmentierung mit denen der manuellen Segmentierung verglichen. Für dieses Experiment haben wir kontrastmittelverstärkte DVT-Scans von 15 großen Tumoren angefertigt. Drei verschiedene Arten der manuellen Konturierung (Abb. 2e, f) wurden von zwei Forschern mit der ITK-Snap-Software durchgeführt, und gemessene Abstände, die der Messung der Messschieber nahekamen, wurden für zusätzliche Vergleiche einbezogen (ergänzende Abb. S3B). Wir beobachteten eine schlechte Übereinstimmung zwischen diesen Methoden (Abb. 2e). Trotz sichtbarer Unterschiede zwischen den Konturierungsstilen ist es erwähnenswert, dass alle Segmentierungen ähnlich und einigermaßen genau aussehen, wenn sie den Scans überlagert werden. Dies deutet darauf hin, dass für die manuelle (oder halbautomatische) Bildsegmentierung, um reproduzierbare Ergebnisse zu liefern, sehr streng definierte Verfahren erforderlich wären. Dieser Ansatz ist außerdem zu zeitaufwändig, um eine praktikable Alternative zur automatischen Segmentierung für die kontinuierliche Überwachung vieler Tumoren darzustellen.

Während eine lineare Beziehung zwischen Tumorvolumina aus der automatischen DVT-Segmentierung und Dickenmessungen durch den primären Tumormesser beobachtet wurde, wenn Tumore zu einem einzelnen Zeitpunkt gemessen wurden (Abb. 2b, „Messgerät Eins“), wurde dies bei Dickenmessungen und DVT-Scans nicht beobachtet wurden parallel im Verlauf realer Experimente gesammelt (Ergänzende Abbildung S3A). Es wurden zwei solcher Experimente durchgeführt, und alle übereinstimmenden Volumenpaare (CT- und Dickenmessungen desselben Tumors am selben Tag) sind in Abb. 3a mit linearen und quadratischen Anpassungen dargestellt. Es scheint, dass Messschiebervolumina unter 200 mm3 fast immer größer waren als das entsprechende CT-Volumen und Messschiebervolumina über 200 mm3 fast immer kleiner als das entsprechende CT-Volumen waren. Ein Koeffizient von nur 0,57 für den Term erster Ordnung der linearen Anpassung ist besonders besorgniserregend, da er darauf hindeutet, dass die Dickenmessung Änderungen im Tumorvolumen erheblich unterschätzt.

Vergleichsvolumendaten von CT- und Caliper-Methoden. (a) Übereinstimmende Paare von Volumenmessungen mit Messschieber- und CT-Methoden desselben Tumors am selben Tag (grün) zeigen lineare und quadratische Anpassungen. (b) Schwarze Punkte stellen übereinstimmende Paare aus (a) dar. Verbindungslinien für jede Maus werden in zufälligen Farben gezeichnet und können sich an weiteren Punkten drehen, an denen für einen bestimmten Tag nur Caliper- oder CT-Daten verfügbar sind und die anderen Koordinaten durch lineare Interpolation zwischen den vorherigen und nächsten Messungen angenähert werden. (c) Histogramm der gemessenen Dicke und CT-Volumina. (d) Bland-Altman-Diagramm (mit logarithmischer x-Achse) der Tumorvolumina der beiden Methoden, das die Volumenabhängigkeit der Unstimmigkeiten zwischen den beiden Methoden zeigt. (e) Venn-Diagramm von Tumoren, bei denen mit den beiden Methoden ein Volumen von genau Null gemessen wurde (kein Tumor erkannt) (aus den in a, b gezeigten übereinstimmenden Paaren). (f) Tumorwachstumskurven für ein Experiment, gemessen mit Messschiebern. Die Tumoren wurden 8, 11 und 14 Tage nach der Implantation mit 8 Gy × 3 XRT behandelt. (g) Wachstumskurven für die gleichen Tumoren wie in Panel (f), gemessen durch automatische CT-Segmentierung. Daten von N = 35 Mäusen aus einem Experiment sind für alle Panels dieser Abbildung enthalten und weitere 25 aus einem zweiten Experiment sind in den Panels (a–e) enthalten.

Die gleichen Daten sind in Abb. 3b dargestellt, jedoch mit linear interpolierten Verbindungslinien zwischen den Punkten für jede Maus. Eine wichtige Beobachtung zu diesen Ergebnissen ist die große Anzahl von Dickenmessungen nahe 100 mm3, die CT-Messungen nahe Null entsprechen. Aus überlagerten Histogrammen dieser Volumina (Abb. 3c) sehen wir, dass der Datensatz hauptsächlich aus solchen Messungen besteht. Ein Bland-Altman-Diagramm zeigt eine starke Größenabhängigkeit der Unstimmigkeiten zwischen den beiden Methoden (Abb. 3d). Beide Methoden meldeten gelegentlich Tumorvolumina von genau Null, allerdings normalerweise nicht für dieselben Tumoren (Abb. 3e).

Um die Diskrepanzen zwischen Tumorvolumina, gemessen durch Messschieber und durch automatische CT-Segmentierung, weiter zu untersuchen, haben wir eine Funktion angepasst, um das Messschiebervolumen aus dem CT-Volumen für jede Maus vorherzusagen (Abb. 4a) und diese Anpassungen verwendet, um die Auswirkung des tatsächlichen Tumors herauszurechnen Volumen auf der Messschiebermessung. Die resultierenden gemessenen Restvolumina (Abb. 4b) waren an manchen Tagen tendenziell höher als an anderen und korrelierten tatsächlich stark mit dem durchschnittlichen Gesamttumorvolumen (Abb. 4c), was auf eine Tendenz hindeutet, die gemeldeten Volumina kleiner Tumoren zu erhöhen, wenn Es sind große Tumoren vorhanden.

Die Tumormessung durch Bildsegmentierung verdeutlicht Fehlerquellen in Messschieberdaten. (a) Tumorvolumenmessungen einer repräsentativen Maus (grün) mit kubischer Passform (gelb). (b) Rest der Dickenmessungen nach Herausrechnung des Effekts des tatsächlichen Tumorvolumens (dünne Linien), aufgetragen mit dem Durchschnitt dieser Reste von jedem Tag (rot) und dem Durchschnitt aller Dickenmessungen von jedem Tag (blaugrün). ). (c) Streudiagramm des durchschnittlichen Restwerts (rote Linie von b) gegenüber dem Durchschnitt der Dickenmessungen für den Tag (blaugrün von b). (d) Wachstumsraten, berechnet durch Subtraktion aufeinanderfolgender Tumorvolumenmessungen von der automatischen CT-Segmentierung. Dies sind Steigungen der gleichen Wachstumskurven wie in Abb. 3g. (e) Wachstumsraten, berechnet durch Subtrahieren aufeinanderfolgender Tumorvolumenmessungen von der Caliper-Methode. Dies sind Steigungen der gleichen Wachstumskurven wie in Abb. 3f. (f) Maximalintensitätsprojektionen eines repräsentativen Scans mit in Cyan hervorgehobenem Tumor. In Richtung der Eigenvektoren werden Pfeile angezeigt, deren Länge proportional zu den Quadratwurzeln der entsprechenden Eigenwerte ist. Der absolute Maßstab der Pfeillängen ist willkürlich und kann zwischen den Panels leicht abweichen. (g) Streudiagramme normalisierter Eigenwerte der Kovarianzmatrix der Tumorvoxelkoordinaten (relativ zum Schwerpunkt) für Tumoren aus Abb. 2 (rot) und Abb. 3 (blaugrün). Farbcodes oben in jedem Feld zeigen den entsprechenden Pfeil in (f) an. Daten von N = 35 Mäusen sind in den Panels (b–e) enthalten. Panel (g) umfasst 20 zusätzliche Mäuse, von denen 18 in Abb. 2b – d dargestellt sind (zwei wurden vom Analyseprogramm aufgrund von Problemen bei der Segmentierung eines der drei Scans ausgeschlossen).

Bemerkenswert ist, dass der Vermesser bei der Aufzeichnung jedes neuen Satzes, wie üblich, direkten Zugriff auf die Messungen der vorherigen Tage hatte. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, eindeutig fehlerhafte Messungen zu melden, bedeutet jedoch, dass die Daten zwischen den Zeitpunkten nicht wirklich unabhängig sind. Tumorwachstumskurven (Abb. 3f) werden wahrscheinlich geglättet, um durch den Einfluss früherer Messungen biologisch plausibler zu erscheinen. Eine unerwünschte Folge davon zeigt sich in den Tumorwachstumsraten, die durch den Vergleich aufeinanderfolgender Volumenmessungen beider Methoden berechnet werden (Abb. 4d, e). In diesem Experiment schrumpften mehrere Tumoren spontan und unerwartet. Der Dickenmesser bemerkte dies, äußerte sich jedoch lautstark skeptisch gegenüber den negativen Wachstumsraten, maß erneut und verzeichnete letztendlich weniger und weniger dramatische Verringerungen des Tumorvolumens, als die Ergebnisse der automatischen Segmentierung schließlich bestätigten.

Wir betrachteten die Tendenz, ähnliche aufeinanderfolgende Messungen desselben Tumors aufzuzeichnen, als möglichen Grund für die beobachtete Diskrepanz zwischen den Abbildungen. 2c und 3a (zusammen dargestellt in der ergänzenden Abbildung S3A), entschieden sich jedoch für die Untersuchung einer alternativen Erklärung, die auf Unterschieden in der Tumorform basiert. Die für Abb. 2 gemessenen Tumoren stammten von der MOC2-Zelllinie und waren größtenteils unbehandelt, während die für Abb. 3 gemessenen Tumoren von der P029-Zelllinie stammten und mit Strahlentherapie behandelt wurden. Es war daher plausibel, dass die Dickenmessungen dazu neigten, das MOC2-Tumorvolumen zu überschätzen und das P029-Tumorvolumen aufgrund eines Unterschieds in der Form zu unterschätzen. Um dies zu untersuchen, haben wir die Eigenzerlegung der Kovarianzmatrix der Koordinaten jedes Tumorvoxels relativ zu seinem Schwerpunkt berechnet (im Wesentlichen Hauptkomponentenanalyse). Eine praktische geometrische Interpretation hierfür ist, dass bei einem perfekt ellipsoiden Tumor das Volumen proportional zum Produkt der Quadratwurzeln der Eigenwerte wäre. Bei diesen Tumoren würden die beiden größten Eigenwerte in etwa den mit Messschiebern gemessenen Abständen entsprechen (Abb. 4e, f, ergänzende Abb. S3B).

Um die Tumorformen zwischen den beiden Experimenten zu vergleichen, haben wir die Eigenwerte „normalisiert“, indem wir die Quadratwurzel gezogen und dann durch die Summe der Quadratwurzeln dividiert haben (Abb. 4f, g). MOC2-Tumoren waren tendenziell länger als P029-Tumoren mit ähnlichem Volumen und hatten relativ kleinere größte Eigenwerte und größere mittlere Eigenwerte. Dies steht im Einklang mit den in Abb. 2b angegebenen höheren Bremssattelvolumina, da der mittlere Eigenwert ungefähr dem kürzeren Bremssattelabstand (oberes Feld der ergänzenden Abbildung S3B) entspricht, der in Gleichung quadriert ist. (1).

Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Hauptvorteil genauerer Tumorvolumendaten eine fruchtbarere Analyse der Tumorwachstumsdynamik wäre. Wachstumskurven für drei Mäuse sind in Abb. 5a mit 3D-Renderings der entsprechenden Tumoren dargestellt, die schädliche Auswirkungen der Tumorform auf die Dickenmessung zeigen. Im ersten Beispiel war der Tumor sehr flach, sodass das Messgerät ihn vollständig verfehlte (Abb. 5a, links). Der nächste Tumor hat eine typische Form und veranschaulicht die scheinbar zufälligen Schwankungen des Bremssattelvolumens zu frühen Zeitpunkten, gefolgt von einer deutlich unterschätzten Wachstumsrate zu größeren und späteren Zeitpunkten, die bei den meisten Mäusen beobachtet werden (Abb. 5a, Mitte). Schließlich reagierte der dritte Tumor nicht so vollständig auf die Strahlentherapie wie die meisten anderen, was sich aus dem hohen CT-Volumen bereits am 18. Tag und erst ab dem 38. Tag aus den Caliper-Daten ergibt (Abb. 5a, rechts).

Die automatische CT-Segmentierung verbessert die Analyse der Wachstumskurve. (a) 3D-Renderings von 3 Tumoren mit unterschiedlichen Formen (oben) und Tumorwachstumskurven für diese Tumoren, gemessen mit CT und Messschieber. Verbindungslinien sind Spline-Anpassungen zweiter Ordnung. (b) Modell zur Anpassung der Tumorwachstumskurven für jede Maus. Der Koeffizient a stellt das Volumen des Tumors zum Zeitpunkt der RT dar, c stellt die Zeit dar, die der Tumor benötigt, um nach der RT zu schrumpfen, d ist das maximale Tumorvolumen, f ist die Rate des Nachwachsens nach der RT und g steht im Zusammenhang mit Das Nachwachsen beginnt nach der RT. Gaußsche Komponenten werden in Rot dargestellt, Logistikkomponenten in Blau und eine Konstante wird in Grün dargestellt. Die hellblaue Funktion ist die Summe dieser Komponenten. (c) Passt zu Tumorwachstumskurven sowohl aus CT- (links) als auch aus Caliper-Messungen (rechts) derselben repräsentativen Maus mit Gaußschen und logistischen Komponenten (gepunktet). (d) Der Vergleich der mittleren CT- und Caliper-gemessenen Volumina zum Zeitpunkt der XRT mit dem Koeffizienten g zeigt eine negative Korrelation bei CT-Messungen, was auf einen Zusammenhang zwischen dem durchschnittlichen Tumorvolumen zum Zeitpunkt der RT und dem Zeitpunkt des erneuten Tumorwachstums nach der RT schließen lässt. (e) Der Vergleich der mittleren CT- und Caliper-gemessenen Volumina zum Zeitpunkt der XRT mit dem Koeffizienten f zeigt eine negative Korrelation bei CT-Messungen, was auf einen Zusammenhang zwischen dem mittleren Tumorvolumen zum Zeitpunkt der RT und der Rate des Tumorwachstums nach der RT schließen lässt. Die Abbildungen (d) und (e) umfassen N = 43 Mäuse (alle Mäuse aus zwei Experimenten, mit Ausnahme von Tumoren, die nie nachwuchsen).

Um den Nutzen genauerer Tumorwachstumskurven zu demonstrieren, haben wir ein einfaches Modell für die Wachstumsdynamik von Tumoren in diesen Experimenten entwickelt, bei denen alle Tumoren mit Röntgenstrahlentherapie (XRT) behandelt wurden:

Dazu gehören ein Gaußscher Wert zur Modellierung des anfänglichen Peaks zum Zeitpunkt der XRT, eine logistische Kurve zur Modellierung der Nachwuchsphase und ein konstanter Term zur Verbesserung der Anpassung an den Bremssatteldatensatz (Abb. 5b). Dies scheint die wichtigsten Merkmale jeder Kurve in einer kleinen Anzahl leicht interpretierbarer Parameter zu erfassen (Abb. 5c). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Tumorvolumina während und kurz nach der XRT einen Hinweis auf die Parameter f (die fraktionelle Rate des Nachwachsens) und g (die Zeit des Nachwachsens) geben könnten, die die letztendliche Nachwuchsphase charakterisieren. In CT-gemessenen Kurven stellten wir fest, dass das durchschnittliche Volumen 8–20 Tage nach der Tumorimplantation negativ mit f und g korrelierte (Abb. 5d, e). Ähnliche Trends können auch in den Caliper-Daten vorhanden sein, jedoch weniger deutlich. Korrelationsstatistiken sind in Tabelle 1 aufgeführt. Interessanterweise gibt es auch eine negative Korrelation zwischen f und sowohl der Kugelform des Tumors (Ergänzungsabbildung S4G) als auch a (Tumorvolumen zum Zeitpunkt der XRT) (Ergänzungsabbildung S5A), aber eine positive Korrelation zwischen c (Zeit, die der Tumor nach XRT zum Schrumpfen benötigt) und g (ergänzende Abbildung S5B). Sowohl a als auch c tragen positiv zu den gemeldeten durchschnittlichen Tumorvolumina bei (Abb. 5d, e), doch die Korrelation zwischen c und g ist in die entgegengesetzte Richtung, was darauf hindeutet, dass die Gaußschen Anpassungsparameter zwei verschiedene Effekte auseinanderhalten könnten: Tumore, die langsam schrumpfen Nach einer XRT dauert es auch länger, bis sie in die Nachwuchsphase übergeht, und Tumore, die vor der XRT schneller wachsen, wachsen langsamer nach. Ähnliche Korrelationen werden auch mit den Tumorformmetriken zu frühen Zeitpunkten beobachtet (Ergänzende Abbildungen S4G, S5C, D). Diese Ergebnisse erfordern eine Validierung und Erklärungen, die über den Rahmen dieses Artikels hinausgehen, zeigen aber, wie eine genauere Tumormessung biologisch interessante Effekte aufdecken kann, die andernfalls unbemerkt bleiben würden.

Ein bemerkenswertes Merkmal der in Abb. 3f gezeigten Dickenwachstumskurven ist, dass einige am Tag 60, als angenommen wurde, dass die überlebenden Mäuse geheilt waren, abrupt von etwa 100 mm3 auf Null abfielen. Eine Maus mit einem Tumor, dessen Volumen 100 mm3 betragen würde, ist tatsächlich nicht unbedingt von einer Maus ohne Tumor zu unterscheiden. Bei kleinen Volumina liegt der Tumor nicht oberflächlich, sondern irgendwo im Wangenmuskel, was die Messung mit der Dicke unzuverlässig macht. Darüber hinaus schwanken die Dickenmessungen kleiner Tumoren im Laufe des Experiments tendenziell, was auf einen anderen kontextuellen menschlichen Einfluss auf die aufgezeichneten Messungen schließen lässt (Abb. 3f, erweitert in der ergänzenden Abb. S3C). In gewissem Sinne ist es sinnvoll, die Messungen mit externen Informationen zu untermauern, da das Vorhandensein großer Tumoren genauer vorhersagen kann, wann die kleinen Tumoren nachwachsen werden, als Beobachtungen der kleinen Tumoren selbst. Aus Sicht der Datenanalyse ist dies jedoch offensichtlich problematisch. Der Bereich der für Tumoren gemeldeten Bremssattelvolumina, deren tatsächliche Volumina wahrscheinlich nahe Null lagen (Abb. 4a), bietet dem Messgerät die Möglichkeit, das für eine Gruppe von Mäusen gemeldete Durchschnittsvolumen erheblich zu verzerren, was eine falsche Hypothese fälschlicherweise bestätigen könnte.

Interessanterweise korrelierten die Caliper-Volumina nicht stärker mit den Volumina aus der aus den Eigenwerten berechneten Ellipsoid-Näherung als mit dem Volumen aus der Voxelzählung insgesamt (ergänzende Abbildung S4A), aber die Korrelation war bei kleinen Tumoren etwas stärker (ergänzende Abbildung S4B). Dies deutet darauf hin, dass die gemeldeten Dickenmessungen nicht mit der Größe des Tumors in den gemessenen Dimensionen in Zusammenhang standen, aber fehlende Informationen über die Dicke des Tumors machen Gl. (1) eine schlechte Annäherung an das Volumen. Dies ist möglicherweise nicht überraschend, da diese gängige Formel im Wesentlichen die kürzere der beiden Dickenmessungen verwendet, um die Dicke anzunähern, die nicht direkt gemessen wird14. Die Annahmen von Gl. (1) In der Literatur wurden wahrscheinliche Erklärungen für die Ungenauigkeit der Tumormessung durch Messschieber im Vergleich zur CT-Segmentierung vorgeschlagen8.

Während die in Abb. 4f,g dargestellte Anwendung der Tumorformanalyse etwas banal ist, zeigt sie eine entscheidende Stärke der Tumormessung durch Bildsegmentierung: in einem Experiment, bei dem einige Tumore so behandelt oder genetisch verändert wurden, dass sich ihre Form, die Dicke, auswirkte Messungen könnten dies als Unterschied im Tumorvolumen erkennen oder einfach den wichtigen Effekt übersehen. Mit segmentierten Scans jeder Maus können wir post-hoc neue Hypothesen über die Tumorform und -lokalisation testen. Beispielsweise variiert die Tumorlokalisation innerhalb von Experimenten (ergänzende Abbildung S4C), ebenso wie der Anteil eines Tumors, der in eine Kugel mit demselben Volumen passen könnte (ergänzende Abbildung S4D), aber die MOC2- und P029-Tumoren weisen in diesen ähnliche Verteilungen auf Metriken (ergänzende Abbildung S4E, F), was darauf hindeutet, dass die Verlängerung von P029-Tumoren möglicherweise nicht auf eine verstärkte Invasion in den Hals zurückzuführen ist. Eine kompliziertere Tumorform wurde mit schlechteren Ergebnissen bei HNC-Patienten in Verbindung gebracht15, ebenso wie die Tumordicke und die Nähe zu Blutgefäßen16, und eine automatisierte Bildsegmentierung könnte bei der Generierung von Daten zur Bestimmung der Bedeutung der Tumorform und -position in Mausmodellen von entscheidender Bedeutung sein.

In der Klinik wird das Ansprechen des Patienten auf die Therapie oft radiologisch anhand der fraktionierten Veränderungen des Tumorvolumens bestimmt. Obwohl die weit verbreiteten Response Evaluation Criteria in Solid Tumors17 (RECIST) auf Distanzen basieren, die auf medizinischen Bildern gemessen werden, und nicht auf Volumina aus der Bildsegmentierung, wird davon ausgegangen, dass die Segmentierung einen überlegenen prognostischen Wert hat18, allerdings auf Kosten einer erhöhten Personalzeit19. Es ist erwähnenswert, dass das Volumen bei weitem nicht der einzige wichtige Aspekt eines Tumors ist und möglicherweise nicht einmal genau die Anzahl der proliferierenden Krebszellen widerspiegelt, da Tumore in ihrer Zellularität variieren20 und nekrotische Regionen enthalten können21. Es handelt sich jedoch um eine biologisch wichtige, messbare Größe, die zum Vergleich von Gruppen von Mäusen mit Tumoren nützlich ist, die ansonsten wahrscheinlich ähnlich wären. Segmentierte CT-Scans werden in der medizinischen Physik häufig für Monte-Carlo-Simulationen verwendet, um die räumliche Verteilung der Strahlendosis zu bestimmen. Obwohl wir Zugriff auf die Ausrüstung und Software haben, um diese Simulationen an Mäusen durchzuführen, ist dies in der Regel nicht der Fall, da die Zeit für die Behandlungsplanung die Anzahl der Mäuse, die behandelt werden können, begrenzt. Eine Automatisierung der Segmentierung könnte diese Situation erheblich verbessern und eine genauere Strahlungsabgabe ermöglichen, die auf die spezifische Geometrie jedes Tumors zugeschnitten ist.

Da die meisten klinischen Studien keinen Einfluss auf die Patientenergebnisse haben22, wird der translationale Wert präklinischer Modelle für menschliche Erkrankungen zunehmend in Frage gestellt. Insbesondere bei Kopf- und Halskarzinomen, wo Immuntherapie- und gezielte Therapieversuche durchweg gescheitert sind23, besteht Bedarf an präklinischer Forschung, um die Wirkung von Medikamenten bei menschlichen Patienten besser vorherzusagen, was teilweise durch eine Verbesserung der Qualität und Quantität der gewonnenen Daten angegangen werden könnte jede Maus. Dazu trägt die hier beschriebene Methode der bukkalen Tumorvermessung bei, ebenso wie die Erkennung von Lungenmetastasen, für die die gleichen Scans ebenfalls eingesetzt wurden. Software zur automatischen Segmentierung von Lungentumoren in CT-Bildern wurde in der Literatur bereits mehrfach beschrieben3,24,25,26,27 und eine vielversprechende zukünftige Richtung könnte darin bestehen, die automatische Messung von Lungenmetastasen in unsere Software zu integrieren, um die Zeit für die Bildanalyse weiter zu verkürzen .

Die Automatisierung der Tumormessung verbessert nicht nur die Genauigkeit und Zuverlässigkeit, sondern auch die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Versuche, präklinische Experimente zur Krebsbiologie zu reproduzieren, werden oft durch eine unzureichende Beschreibung der Methoden untergraben und zeigen in der überwiegenden Mehrheit der Fälle kleinere Effektstärken als ursprünglich veröffentlicht28, was auf weit verbreitete Probleme auf diesem Gebiet hinweist. An vielen Universitäten steht die DVT-Bildgebung für Kleintiere zur Verfügung, entweder für die bildgesteuerte Strahlentherapie oder in eigenständigen Mikro-CT-Geräten. Die Automatisierung der Analyse von DVT-Bildern könnte nicht nur einen umfassenderen Einsatz dieser Technologie fördern, sondern auch die Quantifizierung für absolute Vergleiche des Tumorwachstums zwischen an verschiedenen Institutionen durchgeführten Experimenten standardisieren. Dies hat das Potenzial, die Kosten für das Leben präklinischer onkologischer Experimente an Tieren zu senken und gleichzeitig ihren translationalen Wert für die Medizin zu verbessern.

Leider stehen einem breiten Einsatz der DVT-Bildgebung zur Überwachung des Tumorwachstums bei Mäusen erhebliche Hindernisse im Weg. Dafür ist der Zugriff auf ein geeignetes Bildgebungsgerät erforderlich, und zwar wahrscheinlich über viele Stunden im Verlauf eines Experiments, was für viele Forscher selbst bei der automatisierten Analyse von Multi-Maus-Scans unmöglich oder unerschwinglich teuer sein wird. Darüber hinaus ist unsere Software nicht perfekt und verfügt nur über Funktionen, die für den spezifischen Bildgebungsaufbau und die Experimente erforderlich sind, für die wir sie entwickelt haben, was bedeutet, dass wahrscheinlich zusätzlicher Code geschrieben werden müsste, damit sie in anderen Institutionen verwendet werden kann. Während die hier beschriebene Segmentierungsmethode nur zur Messung von Tumoren verwendet werden kann, die auf einer Seite des Kopfes oder Halses wachsen, ist es bemerkenswert, dass die Scanmethode und ein Großteil des Codes auch auf die Messung von Lungen- und Flankentumoren und möglicherweise anderen anwendbar wären Stellen, an denen Tumore in CT-Bildern leicht identifiziert werden können. Eine einfachere Erweiterung des vorhandenen Codes könnte darin bestehen, das Bild jeder Maus im Wesentlichen mit einem anderen Scan statt mit ihrem Spiegelbild zu registrieren, um die Notwendigkeit zu beseitigen, Tumore auf eine Seite des Kopfes zu beschränken.

Eine bemerkenswerte Einschränkung dieser Studie ist das Fehlen einer Goldstandardmethode zur Volumenbestimmung zur Bestimmung der absoluten Genauigkeit der Methode. Eine scheinbar vernünftige Lösung für dieses Problem wäre, den Tumor herauszuschneiden, wenn jede Maus eingeschläfert wird, und sein tatsächliches Volumen entweder durch Flüssigkeitsverdrängung zu messen oder ihn zu wiegen, um das Volumen aus seiner erwarteten Dichte zu berechnen. Leider schien dies keine praktikable Option für die hier vorgestellten Experimente zu sein, da die Tumoren weitgehend in angrenzendes normales Gewebe eindrangen und eine genaue Entfernung des Tumors ohne normales Gewebe möglicherweise nicht mehr möglich ist, wenn die Mäuse eingeschläfert und vollständig sind. Da diese Art von Daten fehlen, können wir nicht mit Sicherheit über die absolute Genauigkeit der Methode berichten.

Eine weitere Einschränkung des aktuellen Manuskripts ist die geringe Anzahl der untersuchten Tumormodelle. Unterschiedliche Implantationsstellen, Zelllinien und Behandlungen können zu etwas unterschiedlichen Ergebnissen führen. Unsere Erkenntnisse wären auf ein breiteres Spektrum präklinischer onkologischer Experimente anwendbar, wenn wir eine automatisierte Methode zur Messung von Flankentumoren entwickelt hätten, die zur Untersuchung vieler Krebsarten eingesetzt wird. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Messschiebermethode für die Messung von Tumoren in der Flanke genauer ist als im bukkalen Bereich, da es weniger wahrscheinlich ist, dass der Tumor durch normales Gewebe verdeckt wird. Bemerkenswert ist, dass die gravierenden Einschränkungen der Messschiebermethode zur Messung bukkaler Tumoren bei Mäusen offensichtlich waren, bevor diese Daten erfasst wurden, einfach weil es oft schwierig ist zu entscheiden, wo die Messschieber platziert werden sollen oder ob ein Tumor vorhanden ist. Dies gilt nicht unbedingt für Tumoren an anderen Stellen und diese Ergebnisse sollten nicht allgemein auf Dickenmessungen angewendet werden.

Unsere Software könnte wahrscheinlich auch verbessert werden, um durch die Weiterentwicklung verschiedener Module genauere Ergebnisse zu liefern. Beispielsweise haben wir keine Informationen über die Anatomie des Weichgewebes berücksichtigt, die für eine bessere Schätzung der Tumortiefe oder eine genauere Lokalisierung der Mittellinie bei gebeugtem Hals verwendet werden könnten. Die Genauigkeit unserer Tumorsegmentierungen wird zwangsläufig auch durch die Bildgebungsmodalität eingeschränkt. Um eine schnelle Bildgebung einer großen Anzahl von Mäusen zu ermöglichen, wurden CBCT-Scans von relativ geringer Qualität verwendet. Grundsätzlich könnten jedoch hochauflösende MRT- oder Kontrastmittel verwendet werden, um genauere Segmentierungen zu erzeugen, indem Informationen aus dem Weichteilkontrast einbezogen werden.

Trotz dieser technischen Herausforderungen bietet unsere Software mehrere klare praktische Anwendungen für präklinische HNC-Experimente. Eine besteht darin, Gruppen nach der Implantation, aber vor der Behandlung zu randomisieren, um zunächst ähnliche Tumorvolumenverteilungen sicherzustellen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, Veränderungen des Tumorvolumens zu berechnen. Es könnte nützlich sein, die relativen Veränderungen des Tumorvolumens seit Beginn der Behandlung zu vergleichen. Dies wäre jedoch eindeutig nicht für die in Abb. 3f gezeigten Daten geeignet, da die Volumina aus der Dickenmessung zum Zeitpunkt der XRT unrealistisch hoch waren und zu sein scheinen korrelierte nur sehr schwach mit den tatsächlichen Volumina der Tumoren. Die Tumorüberwachung durch automatisierte Bildsegmentierung öffnet die Tür zu einer komplexeren Analyse des Tumorwachstums, wie z. B. Formvergleiche und die Anpassung mathematischer Modelle, und hat großes Potenzial, die Durchführung präklinischer HNC-Experimente positiv zu beeinflussen.

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Tierversuche wurden gemäß den Protokollen durchgeführt, die vom institutionellen Tierpflege- und Nutzungskomitee (IACUC) des Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt wurden. Einige Mäuse wurden eingeschläfert, weil das Tumorvolumen 1000 mm3 überstieg, der Gewichtsverlust mehr als 5 % des Körpergewichts pro Tag über 2–3 Tage betrug oder die Atmung aufgrund von Lungenmetastasen abnormal war. Andere wurden aufgrund von Tumorgeschwüren eingeschläfert, ohne diese Endpunkte zu erreichen. Die angewandte Euthanasiemethode bestand in der Inhalation von Kohlendioxid und anschließender Zervixluxation, entsprechend den Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie von Tieren. Alle Experimente werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien29 gemeldet.

Die für dieses Manuskript analysierten Bilder wurden für Experimente gesammelt, die darauf abzielten, die Rolle der EphrinB2/EphB4-Signalübertragung bei Kopf- und Halskrebs zu untersuchen. Die Auswirkungen dieser Proteine auf das Tumorwachstum gehen jedoch über den Rahmen dieses Manuskripts hinaus, daher werden gepoolte Daten mehrerer Erkrankungen ohne Identifizierung präsentiert. Alle Analysen umfassen alle Mäuse aus dem oder den vorgestellten Experimenten. C57BL/6-Wildtyp- oder EfnB2fl/flTie2-Cre-ERT-Mäuse (genetisch verändertes C57BL/6), denen entweder 100.000 MOC230- oder 50.000 P02931-Zellen in die rechte Wange implantiert wurden. Alle Mäuse waren zum Zeitpunkt der Tumorimplantation etwa 3 Monate alt und weiblich, mit Ausnahme der Daten von 25 Männern, die in den Abbildungen enthalten sind. 3a–e und 5d,e. Die MOC2-Zelllinie wurde von Dr. Ravindra Uppaluri (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)32 erhalten, die P029-Zelllinie vom Xiao-Jing Wang-Labor (University of Colorado, Anschutz Medical Campus). Genetische Manipulationen (um EphB4 auszuschalten/auszuschalten) der MOC2- und P029-Zelllinien wurden von der Functional Genomics Facility des University of Colorado Cancer Center durchgeführt. MOC2-Zellen wurden mit PX458-Kontrollplasmid oder PX458 transfiziert, das gRNA enthielt, die auf EPHB4 und CRISPR-Knockout abzielte (die gleichen Zellen wurden in Bhatia et al., 2022 verwendet)32. P029-Zellen wurden mit shRNA transduziert, die auf murines EphB4 oder unspezifische shRNA abzielte. Einige Mäuse wurden auch mit den Plasmiden TNYL-RAW-Fc (EphB4-Inhibitor) oder PCDNA3 (Kontrolle) behandelt, wie bei Bhatia et al.33, mit der Ausnahme, dass vor der Tumorimplantation zwei Plasmiddosen verabreicht wurden. Das Verfahren zur Implantation von bukkalen Tumoren wurde zuvor von Oweida et al.14 beschrieben. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Tumoren 8, 11 und 14 Tage nach der Implantation mit 8 Gy × 3 XRT behandelt.

Das Programm beginnt mit der Lokalisierung der Zähne, die aufgrund ihrer hohen Dichte leicht zu identifizieren waren, und der Definition von Beschriftungen und Punkten für Vorder-, Unter- und Backenzähne, die in fast allen Scans zuverlässig identifiziert werden können (ergänzende Abbildung S2C). Ausgehend davon wurde der Knochen dann auf ähnliche Weise segmentiert, um Strukturen wie Kiefer, Schädel und Schultern zu identifizieren (Abb. 1e). Eine Reihe von Liniensegmenten, die Punkte an der Mittellinie und entsprechende Punkte auf der linken und rechten Seite des Skeletts im ursprünglichen Scan verbinden, wurden dann auf Liniensegmente einer Struktur abgebildet, die sich an Schnittpunkten biegen kann, um sich an die Position der Maus anzupassen und dabei die Position der Maus beizubehalten Längen der Liniensegmente (Ergänzende Abbildung S2D). Für jedes Liniensegment wird ein lokales Resampling-Gitter berechnet, um einen Teil des Quellscans zu drehen und in die in Abb. 1f gezeigte Ausrichtung zu verschieben. Anschließend werden diese zusammengefügt, um ein einziges krummliniges Resampling-Gitter zu bilden. Ergänzende Abbildung S3E zeigt mittlere Schnitte eines dreidimensionalen Schachbrettmusters, das auf die gleiche Weise neu abgetastet wurde, um zu zeigen, wie das Originalbild verzerrt wurde.

Da die Voxel des neu abgetasteten Scans möglicherweise leicht ungleiche Volumina des realen Raums darstellen, war es notwendig, diese Volumina zu berechnen. Ergänzende Abbildung S2F zeigt eine Karte des maximalen Volumens, das durch ein Voxel entlang dreier Richtungen durch das anfängliche Resampling-Raster dargestellt wird. Rote Bereiche dieser Bilder zeigen, dass die Schultern komprimiert wurden, um eine standardisierte Distanz zu überbrücken. Das Abtastgitter wird dann durch Gradientenabstieg angepasst, wobei der Kopf mit seinem eigenen Spiegelbild mit einer Subpixel-Genauigkeit registriert wird. Dabei wird eine Verlustfunktion verwendet, die ebenfalls die Krümmung beeinträchtigt, einige Voxel jedoch leicht erweitert oder komprimiert (ergänzende Abbildung S2G). Um sicherzustellen, dass der gesamte reale Raum genau einmal gezählt wurde, wurde das von jedem Voxel des neu abgetasteten Bildes dargestellte Volumen aus Volumina einer flexiblen, raumfüllenden Anordnung von 24 Tetraedern pro Voxel berechnet (ergänzende Abbildung S2B).

Sobald die Scans erstellt wurden, wurden sie verarbeitet, um sicherzustellen, dass die Messung des Kopfes nicht durch andere Objekte im Scan beeinträchtigt wurde. Für Scans mit drei und fünf Mäusen wurde ein Koordinatensystem zur konsistenten Analyse erstellt (ergänzende Abbildung S2A). Durch die Verarbeitung der exportierten Scans entstand eine Reihe von Einzelmaus-Scans.

Bei Quellscans, die bis zu drei Mäuse in einer einzigen Reihe in der XY-Ebene enthalten, beginnt die Scanaufteilung mit der Suche nach der Acrylplattform, indem zunächst anhand von 100 gleichmäßig verteilten Voxelspalten ermittelt wird, wo keine Mäuse auf dem Bett ruhten. Entlang dieser Spalten wird der „Bettpunkt“ als der Z-Wert identifiziert, bei dem der größte Unterschied in der Voxelintensität beobachtet und in Kombination mit den zugehörigen x- und y-Werten kommentiert wird. Aus diesen Punkten wurde eine Ebene berechnet und den Voxeln im Bereich unterhalb der Ebene wurde derselbe Intensitätswert wie Luft zugewiesen, wodurch sie effektiv aus dem Scan entfernt wurde. Als nächstes wurden zwei redundante Methoden verwendet, um die Mäuse im Scan horizontal zu trennen. Zunächst wurde die mittlere Voxelintensität jeder YZ-Ebene (Sagittalebene) ermittelt, um ein eindimensionales Signal zu erzeugen, das an den Lücken zwischen Mäusen tendenziell niedrige Werte aufweist. Als nächstes wurde ein Schwellenwert angewendet, um den Zähnen entsprechende Voxel zu isolieren, und ein zweites eindimensionales Signal wurde berechnet, indem die Anzahl der jeder Maus entsprechenden Zahndichte-Voxel addiert wurde. Anschließend wird eine Reihe von Aufteilungsstellen berechnet, indem das erste Signal geglättet und lokale Minima ermittelt werden. Wenn die Anzahl der identifizierten Minima mit der erwarteten Anzahl an Mäusen im Scan übereinstimmt, werden diese zu den endgültigen Aufteilungspunkten. Wenn nicht, wird das zweite Signal auf ähnliche Weise geglättet und seine lokalen Maxima werden als Zentren der Mäuse betrachtet, um die Aufteilungspunkte mit einer alternativen Methode zu berechnen.

Bei Scans mit fünf Mäusen wurden die Teilungspunkte zunächst entlang der Z-Achse für die vertikale Teilung lokalisiert, bevor die mittlere und untere Reihe horizontal geteilt wurden. Die Betthöhen wurden mit der gleichen Methode wie bei den drei Mausscans geschätzt. Allerdings wurden für jede der drei Plattformen drei unterschiedliche Höhenbereiche gefunden, die eine Sortierung in untere, mittlere und obere Plattformpunkte ermöglichen. Diese wurden verwendet, um den Standort jedes Bahnsteigs zu bestimmen. Auch die Zahnfindung bei Fünf-Mäuse-Scans unterschied sich von der bei Drei-Mäuse-Scans. Die maximale Voxelintensität von XY-Scheiben wurde entlang der z-Achse ermittelt, wobei die Höhen jeder Mäusereihe ermittelt wurden, um den Scan in der z-Achse aufzuteilen. Entlang der Z-Achse wurden die Mäuse entweder knapp unterhalb des maximalen Zahnpunkts in jeder Mäusereihe oder knapp über der Plattform, die die Mäusereihe trug, gespalten. Entlang der x-Achse wurden die unteren beiden Reihen aufgrund der Konsistenz des Volumenscans und des großen Abstands zwischen den beiden Mäusen in diesen Reihen in der Mitte des Scans geteilt (Abb. 1c).

Nachdem die Scans aufgeteilt wurden, wurden sie weiter verarbeitet, um unerwünschte Objekte in jedem Scan zu entfernen (Abb. 1d). Anschließend wurde die Summe der Gewebedichte-Voxel in jedem Scan summiert, um festzustellen, ob im geteilten Scan eine Maus vorhanden war. War der Scan leer, wurde er nicht weiter verarbeitet. Das Python-Paket Connected Components 3D wurde verwendet, um unerwünschte Objekte, wie etwa Gliedmaßen benachbarter Mäuse, die manchmal im Ein-Maus-Scan nach der Teilung vorhanden sind, zu identifizieren und zu entfernen. Diese Methode wurde auch zur Entfernung des Anästhesie-Nasenzapfens verwendet. Ein-Maus-Scans, die aus Fünf-Maus-Scans entstanden, erforderten eine zusätzliche Verarbeitung, um die Seiten der Maushalter zu entfernen. Dies wurde erreicht, indem bei jedem Scan eine Ebene an Punkten angepasst wurde, die auf den Kunststoffseiten über der Maus gefunden wurden, in einem Prozess, der dem Entfernen des Bettes ähnelte. Der isolierte Scan jeder Maus wurde dann automatisch auf der Grundlage des Histogramms der Voxelwerte angepasst, um vor der weiteren Analyse sicherzustellen, dass numerisch ähnliche Werte Luft und Weichgewebe entsprechen.

Der gesamte Code wurde in Python geschrieben, wobei hauptsächlich die Standardpakete für wissenschaftliches Rechnen NumPy, SciPy, Pandas und Matplotlib sowie NiBabel und Pydicom zum Lesen und Schreiben von Bilddateien und Connected Components 3D zum Analysieren verbundener Komponenten von Binärbildern verwendet wurden. Die Gesamtarchitektur des Programms wird unten und in der ergänzenden Abbildung S6 beschrieben.

DVT-Scans wurden mithilfe einer Reihe von in Python geschriebenen Modulen verarbeitet, die eine Microsoft Excel-Tabelle mit Scan-Standorten und -Informationen als Benutzeroberfläche integrieren. Diese Module können optional einzelne Ein-Maus-Scans, ausgerichtete Scans nur des Kopfes, Segmentierung von Strukturen einschließlich Tumor, Protokoll aller Verarbeitungsfehler oder Warnungen, Maus-ID-Nummern, Tumorvolumina, Daten, Speicherorte der Quell- und generierten Dateien sowie Debugging zurückgeben Information.

Der Code wurde in 7 Module unterteilt. Zwei lieferten die notwendige Grundlage für die Arbeit mit CT-Scans. Die erste davon, „voxelhelp“, enthielt mehrere Funktionen, die bei der allgemeinen 3D-Bildverarbeitung und -visualisierung helfen sollten. Als nächstes definierte „xradct“ Klassen, die speziell für Ein-, Drei- und Fünf-Maus-Scans gelten, die mit XRAD SmART sowie Annotations- und Segmentierungsobjekten erstellt wurden, um die Benutzerfreundlichkeit dieser Scantypen weiter zu erhöhen.

Die nächsten beiden Module führten den Großteil der Verarbeitung für jeden Scan durch, um jede Maus im Scan zu trennen und das Tumorvolumen zu berechnen. Das Modul „scan_processing“ teilte rohe Drei- und Fünf-Maus-Scans auf, um bereinigte Ein-Maus-Bilder zu erstellen, bei denen Komponenten des Maushalters und des Anästhesie-Setups entfernt wurden, die vom Modul „head_segmentation“ verwendet wurden, um anatomische Merkmale zu lokalisieren und zu segmentieren Bild.

Die letzten drei Module dienten der Organisation und Eindämmung der vorherigen vier. Das Modul „task_controller“ nutzte die Scaninformationen aus der Eingabetabelle, um jeden Scan aufzuteilen und die neuen geteilten Scans zu segmentieren. Das „run“-Modul stellte eine übersichtlichere Schnittstelle zum Ausführen des Codes bereit. Schließlich kann ein zusätzliches Modul namens „process_pool_controller“ als Wrapper für den „task_controller“ fungieren und eine Multithread-Ausführung ermöglichen, sodass viele Scans gleichzeitig analysiert werden können, oder eine alternative Schnittstelle zu den anderen Modulen bereitstellen.

Der XRAD-SmART-Strahler ist für das Scannen eines zylindrischen Volumens von bis zu ca. 10 cm × 10 cm ausgestattet. Wir nutzten diese Möglichkeiten, um eine Längsschnittüberwachung des Tumorwachstums durchzuführen und qualitative Daten zur Tumorgröße zu erhalten. Die Mäuse wurden mit einer Isoflurankonzentration von 1–2 % anästhesiert und in Bauchlage mit einem kleinen Nasenkegel in der Maschine in das XRAD-SmART gebracht, um unter Narkose zu bleiben. Bei der Bildgebung bukkaler Tumoren wurden die Vorderbeine normalerweise hinter die Schultern zurückgezogen, um mögliche Probleme bei der Bildsegmentierung zu vermeiden (Abb. 1b, ergänzende Abb. S1D). In einigen Fällen wurde eine kurze Durchleuchtung durchgeführt, um die korrekte Positionierung aller Mäuse im scannbaren Volumen sicherzustellen, gefolgt von einem vorläufigen „Scout“-DVT-Scan mit niedriger Auflösung, um das zu rekonstruierende Volumen für nachfolgende Bilder auszuwählen. CBCT-Scans wurden entweder mit Scanvoreinstellungen für hohe Dosis (0,1 mm Voxel) oder niedrige Dosis (0,2 mm Voxel) mit 80 kVp- oder 60 kVp-Röntgenstrahlen, gefiltert durch 0,8 mm Beryllium und 2 mm Aluminium, erfasst. Anschließend wurde jede Maus aus der Maschine entfernt und in ihren Käfig zurückgebracht, um sich zu erholen, während der Computer mit der Rekonstruktion des Bildes fertig war. Die Scans wurden zur Analyse aus der Software Pilot XRAD 1.18.3 als DICOM-Dateien exportiert. Für die kontrastverstärkte Bildgebung (Abb. 2e, f) wurden 15 Minuten vor der Bildgebung mit 80-kVp-Röntgenstrahlen und einem Voxelabstand von 0,1 mm 200 µl Iohexol durch die Schwanzvene injiziert. Alle Scans, die nicht für die manuelle Tumorsegmentierung verwendet wurden, wurden mit Nr Kontrastmittel.

Um die gleichzeitige Bildgebung von drei Mäusen gleichzeitig zu ermöglichen, haben wir das Anästhesiesystem im Bestrahlungsgerät modifiziert, indem wir das Isofluranröhrchen in mehrere kleinere geteilt und diese an einer breiten Acrylplattform befestigt haben (ergänzende Abbildung S1D). Da jedoch jeder Käfig in unserem Vivarium bis zu fünf Mäuse beherbergen kann, kamen wir zu dem Schluss, dass das gleichzeitige Scannen von fünf Mäusen die Effizienz größerer Studien erheblich steigern würde, da dadurch jeder Käfig einzeln gescannt werden kann. Um diese Scans zu erhalten, haben wir ein Gerät entwickelt, um fünf Mäuse zu halten und zu betäuben. Ein 3D-gedruckter Rahmen enthält kleine Plastikstücke in Form von drei halbfünfeckigen Schlitzen für drei Mäuse. Diese Baugruppe wird dann über zwei weiteren Mäusen unter weiteren 3D-gedruckten Objekten aufgehängt, die auf die Acrylplattform geklebt sind. Der Fünf-Mäuse-Halter wurde so konzipiert, dass er in den 10-cm-Durchmesser des zylindrischen Scanvolumens passt und alle fünf Mäuse ungefähr im gleichen Abstand von der Drehachse der Gantry hält, was wichtig ist, da die Bildqualität mit diesem Abstand variiert. Die Mäuse wurden zuerst in der Induktionskammer betäubt, dann wurden die beiden unteren Mäuse mit der Nase zu den Anästhesieschläuchen liegend positioniert. Die oberste Ebene des Geräts wird über die unteren beiden Mäuse gelegt, und die restlichen Mäuse werden in den drei oberen Halterungen in derselben Position wie die beiden unteren positioniert. Mäuse wurden mit der niedrigeren voreingestellten Auflösung gescannt, um die Scan-Verarbeitungszeit zu verkürzen.

Die Zeitmessung der CBCT-Scans erfolgte mithilfe einer Kombination aus Stoppuhrdaten und Zeitstempeln, die dem Beginn jedes Scans zugeordnet waren. Die Messung der Dicke erfolgte mit einer Stoppuhr. Es stellte sich heraus, dass die mit der Einrichtung beider Messmethoden verbundenen Zeiten ähnlich waren, sich jedoch so stark unterschieden, dass sie in den Gesamtzeitdaten nicht berücksichtigt wurden.

Die in Abb. 5a gezeigten Wachstumskurven wurden durch Anpassen von Splines zweiter Ordnung mit scipy.interpolate.UnivariateSpline generiert. Um mögliche Auswirkungen der an verschiedenen Tagen gesammelten Messschieber- und CT-Daten abzumildern, haben wir diese Splines auch verwendet, um die Wachstumskurven an 10 Punkten 8–20 Tage nach der Implantation erneut abzutasten, und diese Werte gemittelt, um die in Abb. 5d angegebenen Tumorvolumina zu erhalten . Anpassung von Gl. (2) Um Volumendaten zu erzeugen, wurde scipy.linalg.lstsq() verwendet.

Alle Korrelationskoeffizienten wurden mit den SciPy-Funktionen scipy.stats.pearsonr() und scipy.stats.spearmanr() berechnet. Mithilfe der Funktion scipy.stats.f_oneway() wurden Einweg-ANOVA-Tests durchgeführt, bei denen die Dickenvolumina für alle Gruppen innerhalb jedes Experiments an jedem Tag verglichen wurden, an dem Dickendaten für alle Mäuse verfügbar waren. Der p-Wert für jeden Test war > 0,05, mit Ausnahme des in Abb. 3f,g gezeigten Experiments, das 23 Tage nach der Implantation einen ANOVA-p-Wert von 0,04 und f = 2,85 aufwies. Dies wurde mit GraphPad Prism bestätigt, aber ein Sidak-Folgetest, bei dem jedes Paar von Gruppen verglichen wurde, die sich in genau einer Hinsicht unterschieden, ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen. Die Anpassung der ANOVA-p-Werte für Vergleiche an mehreren Tagen ergab ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede .

Bildanalysecode wird auf GitHub verfügbar sein. Daten zum Tumorvolumen sind in den ergänzenden Excel-Dateien S1–S4 enthalten. DVT-Scans sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Abbildung 1b und ergänzende Abbildung S1D wurden von BN für dieses Manuskript gezeichnet. Diese Arbeit wird vom National Institute of Dental and Craniofacial Research des SDK (Zuschuss-Nr. 1R01DE028282-01, 1R01DE028529-01) und durch Zuschuss-Nr. 1P50CA261605-01 (SDK) und das NCI (R01 CA284651-01).

Abteilung für Radioonkologie, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, Aurora, USA

Benjamin Van Court, Brooke Neupert, Diemmy Nguyen, Richard Ross, Michael W. Knitz und Sana D. Karam

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Konzeptualisierung: BVC, BN, SDK Methodik: BVC, BN Software: BVC, BN Untersuchung: DN, BN, BVC, MWK Visualisierung: BVC, BN Überwachung: SDK Schreiben – Originalentwurf: BVC, BN Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: BVC, SDK, RR

Korrespondenz mit Sana D. Karam.

Dr. Karam erhält klinische Mittel von Genentech, Ionis und AstraZeneca sowie präklinische Mittel von Roche für Arbeiten, die nichts mit diesem Manuskript zu tun haben. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Van Court, B., Neupert, B., Nguyen, D. et al. Messung von Kopf- und Halstumoren von Mäusen durch automatisierte Analyse von DVT-Bildern. Sci Rep 13, 12033 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39159-6

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Eingegangen: 28. April 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39159-6

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Messung von Kopf- und Halstumoren von Mäusen durch automatisierte Analyse von DVT-Bildern