Bioarchäologische und paläogenomische Profilierung der ungewöhnlichen neolithischen Bestattung in der Grotta di Pietra Sant'Angelo (Kalabrien, Italien)

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11978 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das neolithische Grab der Grotta di Pietra Sant'Angelo (CS) stellt einen einzigartigen archäologischen Fund für die Vorgeschichte Süditaliens dar. Die ungewöhnliche Platzierung der Grabstätte in ziemlich großer Höhe und weit entfernt von bewohnten Gebieten, das Fehlen von Bestattungsgeräten und die liegende Beisetzung des Leichnams weisen begrenzte Ähnlichkeiten mit zeitgenössischen italienischen Stätten auf. Diese Elemente haben umfassendere Fragen zu den Bestattungsbräuchen in der Vorgeschichte Süditaliens aufgeworfen. Dieser atypische Fall erfordert einen interdisziplinären Ansatz mit dem Ziel, ein integriertes bioarchäologisches Profil des Individuums zu erstellen. Die paläopathologische Untersuchung der Skelettreste ergab das Vorhandensein zahlreicher Marker, die mit handwerklichen Tätigkeiten in Verbindung gebracht werden könnten, was mögliche Interpretationen des Lebensstils des Individuums nahelegt. CT-Analysen der Oberkieferknochen zeigten das Vorhandensein einer besonderen Art von Zahnabnutzung, aber auch eine gute Dichte der Knochenmatrix. Biomolekulare und mikromorphologische Analysen von Zahnstein belegen das Vorhandensein eines reichhaltigen neolithischen oralen Mikrobioms, dessen Zusammensetzung mit den vorhandenen Pathologien übereinstimmt. Schließlich wurden die vom Individuum erhaltenen paläogenomischen Daten mit antiken und modernen Mittelmeerpopulationen verglichen, einschließlich unveröffentlichter hochauflösender genomweiter Daten für 20 moderne Bewohner des nahegelegenen Dorfes San Lorenzo Bellizzi, die interessante Einblicke in die biodemografische Landschaft des Neolithikums lieferten in Süditalien.

Am Ende des sechsten Jahrtausends v. Chr. sind neolithische Lebenswege in Süditalien (SI) gut etabliert1. Keramik taucht in den archäologischen Aufzeichnungen der frühen und mittleren Jungsteinzeit in Apulien, Basilikata und Kalabrien auf; Das Wirtschaftssystem der Jagd und des Sammelns beginnt durch die Ausweitung landwirtschaftlicher Aktivitäten ersetzt zu werden, auch wenn ein vollständiger Übergang zu einer auf der Landwirtschaft basierenden Subsistenzstrategie erst in der Bronzezeit erfolgt2. Radikale Veränderungen sind in den Siedlungsstrategien während der frühen und mittleren neolithischen Phase in SI zu beobachten, die hauptsächlich auf der Besetzung von Küsten- und Küstengebieten basieren, wie z. B. Favella di Corigliano (CS), einem der ältesten Bauerndörfer Italiens Italien und eine der ersten Töpferindustrien in Mittelwesteuropa3. Im Gegensatz dazu gibt es bis in die fortgeschrittenen Phasen des Neolithikums nur sporadisch Hinweise auf die Anwesenheit von Menschen in den inneren Gebieten von SI. In diesem Zusammenhang stellt die archäologische Stätte der Grotta di Pietra Sant'Angelo ein Unikat für die menschliche Ausbeutung von SI während der Jungsteinzeit dar.

Pietra Sant'Angelo ist ein ausgedehntes Kalksteinmassiv auf der kalabrischen Seite des Pollino-Nationalparks (Abb. 1a) in der Gemeinde San Lorenzo Bellizzi (Cosenza). Das Massiv ist äußerst reich an Hohlräumen. In der Gegend wurden mindestens 21 vertikale und horizontale Höhlen untersucht. Unter ihnen bewahrt die Grotta di Pietra Sant'Angelo die ältesten Zeugnisse menschlicher Aktivität in Nordkalabrien4. Die Lage des Hohlraums (Abb. 1b) in ziemlich großer Höhe (> 1000 m ü. M.) und vom Tal aus nicht leicht sichtbar, hat es ihm ermöglicht, Störungen nach der Ablagerung zu überstehen. Die stratigraphische Rekonstruktion der archäologischen Lagerstätte bezeugt eine konsequente Nutzung des kleinen Hohlraums (weniger als 20 m Länge) während der gesamten Jungsteinzeit, was durch das Vorhandensein von Trichrom-, Bichrom- und Prägekeramik nahegelegt wird, während es nur wenige und sporadische Hinweise auf eine neuere Form gibt Frequentierung ist nachgewiesen.

(a) Geografische Lage von San Lorenzo Bellizzi. Die Karten wurden vom National Geologic Map Database-Projekt (https://ngmdb.usgs.gov/topoview/) bezogen und mit Adobe Illustrator 2022 v3.0 (verfügbar unter https://www.adobe.com/products/illustrator/) angepasst. ); (b) Pietra Sant'Angelo-Massiv und der Eingang der gleichnamigen Höhle (schwarzer Kreis); (c) Planimetrie der Höhle und Ort der Bestattung (rotes Quadrat); Umfang der Ausgrabungen ist grün hervorgehoben; (d) die Skelettreste des Individuums, wie sie in der Höhle gefunden wurden; (e) die intakten Kiefer des Individuums; Fotos von Felice Larocca (b, d) und Alessandra Cinti (e).

Die seit 2017 durchgeführten archäologischen Ausgrabungen ergaben das Vorhandensein einer einzelnen Bestattung, die sich nur wenige Meter vom Eingang der Höhle entfernt befand (Abb. 1c). Die Skelettreste (Abb. 1d) wurden in einer ovalen Grube gefunden, die direkt in den Boden gehauen wurde: Die begrabene Person (im Folgenden SLB) wurde auf dem Bauch liegend, nach Osten und Westen ausgerichtet, mit dem Gesicht zur Erde und in einer extrem zusammengezogenen Position aufgefunden; Mittelgroße Steine ​​bedeckten den Schädel und die rechte Körperseite, kleinere Steine ​​lagen über dem Becken, dem Rumpf und den Gliedmaßen. Trotz einer beständigen anthropogenen Präsenz in der Höhle, die durch Hinweise auf Keramikfragmente im Zusammenhang mit der Diana- und Serra d'Alto-Fazies5 gekennzeichnet ist, gab es in der Höhle keine weiteren Anzeichen von Bestattungsaktivitäten. Das Fehlen von Grabbeigaben sowie die Verwendung einer einfachen Grube in einer Höhle führten zu einer neolithischen Kontextualisierung der Bestattung. Dies wurde später durch eine Radiokarbonanalyse bestätigt, die SLB dem Mittelneolithikum zuordnete (6092 ± 45 v. Chr.; 5207–5048 cal v. Chr., 19,1 %/5084–4899 cal v. Chr., 74,8 %/4864–4853 cal v. Chr., 1). ,5%)6. Allerdings stellt die Person aus der Grotta di Pietra Sant'Angelo eine interessante Ausnahme in der Grablandschaft des italienischen Neolithikums dar: Einzelne Inhumationen während der frühesten und fortgeschritteneren Phasen des Neolithikums in SI finden sich im Allgemeinen im häuslichen Bereich, mit dem Körper auf einer Seite liegend, meist in direkt in den Boden gehauenen Gruben oder in Silos und Nischen begraben7,8,9. Hinweise auf Leichenablagerungen weit entfernt von bewohnten Gebieten finden sich im gesamten Neolithikum in echten apulischen Bestattungskontexten wie Nekropolen10 und Grabhöhlen11,12. In Anbetracht der Lage der Höhle und der Probleme, die aufgrund der steilen vertikalen Felsen beim Zugang zu ihr entstehen, stellt diese Bestattung jedoch einen einzigartigen archäologischen Marker für die neolithische Präsenz des Menschen in den Bergen von SI dar. Darüber hinaus wirft die ungewöhnliche Platzierung der Bestattung innerhalb der Höhle, die nur wenige Meter vom Eingang entfernt liegt und teilweise natürlichem Licht ausgesetzt ist, Fragen zu den Bestattungsgewohnheiten neolithischer Menschen in SI und insbesondere zur Lebensgeschichte des Einzelnen auf. Wir fragten uns, ob die genetische Abstammung, der Gesundheitszustand, der Beruf oder die soziale Identität irgendwie mit der unkonventionellen Bestattung zusammenhängen könnten. Ein gut etablierter methodischer Ansatz, der biomolekulare Archäologie, physikalische Anthropologie und Archäothanatologie13,14,15,16 kombiniert, konnte Antworten auf einige dieser Fragen liefern und uns dabei helfen, ein nahezu vollständiges bioarchäologisches Profil des Individuums zu rekonstruieren. Anthropologische und paläopathologische Untersuchungen der Überreste wurden durch Computertomographie-Scans des Unter- und Oberkiefers ergänzt (Abb. 1e). Das Vorhandensein von Zahnstein ermöglichte die Charakterisierung der in der Mineralmatrix eingeschlossenen Mikrotrümmer sowie die Gewinnung interessanter Informationen über die Zusammensetzung des oralen Mikrobioms und den potenziellen Krankheitszustand dank der Kombination von Metagenomik- und Paläoproteomik-Analysen. Schließlich wurden durch Shotgun-Sequenzierung ein vollständiges mitochondriales Genom und die ersten vollständigen Genomdaten aus dem prähistorischen Kalabrien erstellt. Tatsächlich wurden zwar antike DNA-Ansätze zur Untersuchung des neolithischen Übergangs in Nord-17,18,19, Mittel-20 und Inselitalien21,22,23 angewendet, für das prähistorische SI24,25,26 wurden jedoch nur wenige antike DNA-Daten erstellt24,25,26 und sehr wenige ist über die paläogenomische Landschaft Kalabriens bekannt27. Daher wurden die hier gewonnenen Genomdaten im Kontext der modernen und antiken Variabilität mediterraner Populationen untersucht. Um unser Verständnis der Populationsdynamik zu verbessern, wurden Proben von 20 modernen autochthonen Individuen aus dem Dorf San Lorenzo Bellizzi gesammelt und auf etwa 720.000 genomweite Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) genotypisiert.

Die Skelettreste des Individuums wurden in einer sehr zusammengezogenen Position gefunden, wobei der Oberkörper auf dem Bauch lag, das Gesicht auf dem Boden der Grube ruhte und die Ellbogen und Knie gebeugt waren. Beide Unterarme wurden unter den Körper gelegt, die unteren Gliedmaßen wurden auf der rechten Seite wieder zusammengefügt und mit den Beinen in Hyperflexion auf den Oberschenkeln angeordnet. Der Unterkiefer und der Oberkiefer befanden sich in vollständiger Okklusion. Der primäre Charakter der Ablagerung wurde durch die korrekte anatomische Anordnung der Skelettelemente und durch das Fortbestehen labiler Verbindungen definiert; Das Fehlen einer Trennung der Wirbelräume, die Aufrechterhaltung des Volumens des Brustkorbs und die anatomische Verbindung der Knochen von Händen und Füßen lassen darauf schließen, dass die Zersetzung in einer gefüllten Grube stattfand28. Die Person, ein erwachsener Mann im Alter von ± 30 Jahren und etwa 164 cm ± 3 cm groß, zeigte extreme Abnutzungsmuster an den Zähnen (Abb. 2a), die zu einem vollständigen Verlust der Kronenhöhe in den unteren Schneidezähnen führten. Der Zahnschmelz ist auf der Kaufläche nahezu nicht vorhanden, so dass eine nahezu durchgehende Dentinoberfläche verbleibt, die teilweise von einem Zahnschmelzrand umgeben ist, was zu einer deutlichen Verkleinerung der Zahngröße führt.

(a) Unterkieferteil der Kiefer mit sichtbaren extremen Abnutzungsmustern; (b) stereomikroskopische Bilder der Okklusionsflächen der unteren Schneidezähne und Eckzähne mit deutlichen Anzeichen von Streifen (unten und in der Mitte) und Brüchen (oben); (c) CT-Bilder der Kiefer.

Stereomikroskopisch waren zahlreiche Streifen in alle Richtungen auf den Okklusionsflächen der unteren Schneide- und Eckzähne sichtbar (Abb. 2b) sowie Kronenbrüche und Absplitterungen an den vorderen Unter- und Oberkieferzähnen. Es liegt ein ausgeprägterer schräger Verschleiß an der lingualen Oberfläche der Oberkieferzähne und an der bukkalen Oberfläche der Unterkieferzähne (Reibung) vor, zusammen mit Abnutzungserscheinungen an der Zahnoberfläche (Abrasion), die besonders deutlich an den ersten Molaren des Unterkiefers und Oberkiefers zu erkennen sind ; Auch Absplitterungen und Brüche der Kronen an den Seitenzähnen (Molaren) sind sichtbar. Es liegt eine diffuse Rezession des Alveolarknochens und eine Freilegung der Zahnwurzeln sowie ein intravitamer Verlust des zweiten rechten Oberkieferprämolaren vor, wahrscheinlich infolge eines Abszesses im Alveolarknochen. Es wurden auch geringe Mengen an Zahnstein auf den Zahnoberflächen festgestellt.

Die CT-Untersuchung der Kiefer (Abb. 2c) ergab eine gute Dichte der Knochenmatrix, die mit dem Alter der Person übereinstimmt; Auf der Alveolarebene ist eine allgemeine Knochenresorption sichtbar, was auf das Vorliegen einer parodontalen Erkrankung hinweist, die zum Verlust des zweiten Prämolaren im Oberkiefer hätte führen können. Die Beziehungen zwischen den beiden Kieferknochen zeigen ein Vorwärtsgleiten des Unterkiefers (Klasse III) bei Kopf-an-Kopf-Schließung der Schneidezähne. Es ermöglicht uns, eine ursprüngliche Position des Unterkiefers (in Klasse I) abzuschätzen, die sich im Laufe der Zeit aufgrund der mangelnden okklusalen Unterkiefer- und Oberkieferstabilität verändert hat.

Bezüglich des postkraniellen Skeletts wurden abnormale Muster der Knochenbildung oder -zerstörung auf der Ebene der Gelenke beobachtet. An der rechten und linken oberen Extremität (proximale Epiphyse der rechten Ulna und distale Epiphyse des rechten und linken Radius) sowie am Beckengürtel (linke Hüftpfanne) wurden mäßige marginale Osteophyten nachgewiesen. Eingedrückte Flächen mit glatten Kanten wurden auf der rechten distalen Oberfläche der Trochlea humeri (10 mm lang), auf der hinteren Oberfläche des linken und rechten Fußwurzelknochens (ungefähr 3 mm lang) und auf der ersten proximalen Phalanx des rechten Zehs (konkal) beobachtet proximale Facette, 10 mm lang). Solche Muster sind typisch für Osteochondrosis dissecans, einen pathologischen Zustand des subchondralen Knochens, der den Knorpel der Synovialgelenke trägt und in einer teilweisen oder vollständigen Ablösung des Gelenkknorpels vom subchondralen Knochen besteht29. An den Schäften wurden Muster abnormaler Knochenbildung und -zerstörung festgestellt. Es ist eine unspezifische Periostitis an den Mittelschäften der Schien- und Wadenbeine sichtbar, und es liegen mäßige abnormale Knochenformationen in Form von Enthesopathien vor, die die untere Oberfläche beider Schlüsselbeine am Ansatz des Bandes des Processus conoideus und an den Stellen der Beugesehnen betreffen auf der palmaren Oberfläche der proximalen Handphalangen. Entlang der unteren Oberfläche des rechten Schlüsselbeins am Ansatz des Ligamentum costoclaviculare (Fossa rhomboideus) sind ausgeprägte ovale Furchen erkennbar. Am linken Schlüsselbein erscheint die Läsion als mäßige Depression (Enthesopathie), während am oberen Humerusschaft eine mäßige Depression am Ansatz des Musculus pectoralis major vorliegt. Es wurden auch abnormale Knochenformen festgestellt, die wahrscheinlich auf einen Grünholzbruch des rechten Schlüsselbeins und eine Rückwärtsneigung des Tibiaplateaus zurückzuführen sind.

Schließlich kommt es am Ansatz des unteren Glenoidlabrums zu einer seitlichen Erweiterung der Gelenkfläche der rechten Glenoidhöhle; Es sind keine Verknöcherungen von Bändern und Sehnenansätzen sowie keine Osteophyten vorhanden, was auf eine mögliche Instabilität oder Flexibilität des Schultergelenks schließen lässt. Auf der Vorderfläche der Talustrochlea und am Vorderrand des unteren Endes der Tibiaverlängerung sind Hockfacetten vorhanden, was auf einen gewohnheitsmäßigen Kontakt zwischen den beiden anatomischen Elementen hinweist29.

Die Mikrodebris-Analyse von Zahnstein ergab das Vorhandensein einer Vielzahl von schlecht diagnostischen Mikroresten (Ergänzende Informationen). Die meisten davon waren pflanzlichen Ursprungs und bestanden aus Stärkekörnern (Ergänzungsabbildung 2A), Pflanzengeweben (Ergänzungsabbildung 2B) und einem Trichom (Pflanzenhaare, Ergänzungsabbildung 2C), konnten jedoch in den meisten Fällen nicht einmal zugeordnet werden bis zur Familienebene. Zwei der geborgenen Pflanzenreste stimmten mit Fasern überein (ergänzende Abbildung 2D, E), waren aber auch von geringer diagnostischer Natur. Dunkelbraune Partikel (ergänzende Abbildung 2G) könnten ein Hinweis auf Mikrokohle sein, es mangelte ihnen aber auch an sicheren Unterscheidungsmerkmalen, weshalb sie als „verbrannte Trümmer“ beschrieben wurden – um ihrer unsicheren Natur Rechnung zu tragen. Es gab auch mineralischen Splitt (ergänzende Abbildung 2F), aber die optische Mikroskopie allein erlaubt die Identifizierung solcher Überreste nicht und wird Gegenstand künftiger Analysen sein. Trotz der schlechten diagnostischen Natur der Überreste deuten sie auf den Verzehr von stärkehaltiger Nahrung und Blattfrüchten hin. Das Vorhandensein von Überresten wie Fasern und Mineralsplitt, die möglicherweise zur Zahnabnutzung der Person beigetragen haben, könnte auch mit beruflicher Tätigkeit in Verbindung gebracht werden. Die sehr begrenzte Menge potenzieller Textilfasern und deren unsichere Identifizierung erschweren jedoch eine eindeutige Interpretation. Tatsächlich können Fasern auch in Zahnsteinproben gefunden werden, für die keine Zahnabnutzungsmuster gemeldet wurden30, und daher ist bei der Interpretation dieser Überreste äußerste Vorsicht geboten.

Eine paläogenomische Analyse des Zahnsteins wurde durchgeführt, um die alte orale mikrobielle Gemeinschaft von SLB zu definieren. Einzelsträngige Genombibliotheken wurden aus alten DNA-Extrakten von Zahnstein erstellt und auf der Illumina HiSeq X-Plattform sequenziert, was 7.695.982 Paired-End-Reads ergab. Wir verwendeten HOPS31, ein Tool, das speziell für die taxonomische Charakterisierung kurzgelesener metagenomischer Schrotflintendaten entwickelt wurde. Im Zahnstein wurden mehrere wirtsassoziierte Bakterien identifiziert, darunter verschiedene Mitglieder der Gattungen Treponema, Prevotella, Streptococcus und Methanobrevibacter (eine Liste der 50 am häufigsten im Zahnstein identifizierten Mikrobenarten finden Sie in der Ergänzungstabelle S1). ). Wie bei Zahnsteinproben erwartet, wurden auch Mitglieder von Bakteriengattungen nachgewiesen, die sowohl mit dem menschlichen Wirt als auch mit der Umwelt assoziiert sind (z. B. Actinomyces spp., Streptomyces sp. und Pseudomonas spp.). Der antike Ursprung wurde durch Auswertung der Anzahl der Lesevorgänge für jedes spezifische Taxon, des Post-Mortem-Degradations-Scores (PMDS), des negativen Differenzanteils-Scores (−Δ %) und des Vorhandenseins eines Desaminierungsmusters im CT validiert. Taxa mit mehr als 300 zugewiesenen Lesevorgängen, mehr als 50 Lesevorgängen mit PMDS > 1, − Δ % > 0,9 und Mustern des CT-Übergangs bei 5‘ wurden als antiken Ursprungs angesehen (Ergänzungstabelle S1). Eine große Anzahl von Lesevorgängen wurde zugeordnet zuvor identifizierte humane orale Taxa zeigten anhaltende Desaminierungs- und Substitutionsprofile, die mit alter DNA übereinstimmen (z. B. Treponema denticola, Actinomyces dentalis, Streptococcus gordonii, Methanobrevibacter oralis, Porphyromonas gengivalis, Prevotella intermedia). Von den gefundenen Arten stellen Treponema denticola, Tannerella forsythia und Porphyromonas gingivalis das pathogenste Aggregat oraler Bakterien dar, nämlich den „roten Komplex“, der nachweislich stark mit parodontalen Erkrankungen assoziiert ist32,33. Das Vorkommen dieser drei Arten in Bezug auf die Anzahl der Lesevorgänge (Tabelle S1) entspricht der erwarteten Häufigkeit, wie in anderen Studien hervorgehoben wurde34. Die aus Zahnstein ermittelten oralen Metagenome wurden in der Hauptkoordinatenanalyse (Abb. 3) mit verfügbaren antiken oralen Mikrobiomdaten von Neandertalern (n = 14, grün), vorlandwirtschaftlichen (n = 51, orange) und neolithischen (n = 16) verglichen , gelb), Prä-Antibiotika (n = 15, blau) und modernen (n = 18, hellblau) Ursprungs35,36. Bemerkenswerterweise gehören 16 dieser Metagenome zu antiken italienischen Individuen, die geografisch und zeitlich mit unserer Stichprobe übereinstimmen. Das orale Mikrobiom von SLB (roter Punkt) liegt in der Nähe von Proben neolithischen/vorlandwirtschaftlichen Ursprungs, was auf eine große Gemeinsamkeit von Taxa mit Mikrobiomen dieser Zeit hinweist, wie das Alter der Probe erwarten lässt. Um die metagenomische Komponente des Individuums weiter zu untersuchen, wurden alte DNA-Sequenzen, die aus Zahndentin von SLB erzeugt wurden (siehe Abschnitt „Alte menschliche DNA“), auch auf die häufigsten bakteriellen Krankheitserreger untersucht, wie in der Literatur vorgeschlagen37,38. Nach unseren Erkenntnissen wurden keine DNA-Spuren potenzieller Krankheitserreger gefunden (Ergänzungstabelle S2). Es muss jedoch beachtet werden, dass die Krankheitserreger-DNA aufgrund der Beschaffenheit und Dicke der verschiedenen bakteriellen Zellwände39 oder weil einige Krankheitserreger nicht in den Blutkreislauf gelangen und höchstwahrscheinlich nicht nachweisbar sind, möglicherweise nicht über die Zeit auf dem Dentin erhalten geblieben ist40. Darüber hinaus ist unsere Analyse völlig blind gegenüber Viren, insbesondere RNA-Viren, deren genetisches Material in antiken Proben kaum erhalten ist, und es wurden bisher nur wenige Versuche zur Sequenzierung antiker Transkriptome veröffentlicht41.

Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) des antiken oralen Mikrobiomgehalts für SLB (rot) und 114 Proben von Neandertalern (grün), präagrarischen (orange), neolithischen (gelb), präantibiotischen (blau) und modernen Menschen (hellblau). Ellipsen geben die 95 %-Konfidenzbereiche basierend auf dem Standardfehler der Mittelwerte der Entfernungen zwischen Stichproben derselben Gruppe an.

Die Paläoproteomik einer kleinen Zahnsteinprobe ergab 1309 eindeutige Proteintreffer (ergänzender Datensatz). Davon gehören 27 zum Wirt (Ergänzungstabelle S3) und die meisten (20) sind mit dem angeborenen Immunsystem assoziiert (Ergänzungstabelle S3). Andere hängen mit der Blutstillung, dem Proteinstoffwechsel und der Verdauung von Nahrungskarbonaten (Amylasen) zusammen. Die meisten der identifizierten Proteine ​​waren bakteriellen Ursprungs (1271). Die Analyse der taxonomischen Zusammensetzung des antiken Mikrobioms wird durch die Tatsache erschwert, dass dieselbe Peptidsequenz in mehreren Taxa vorkommen kann, was zu mehreren Treffern führt. Betrachtet man jedoch die Taxa, die die meisten Proteintreffer ergaben, Arachnia spp., Actinomyces spp., Streptococcus spp., Fusobacterium spp., Corynebacterium spp., Olsenella spp. und Ottowia spp. sind am stärksten vertreten. Alle diese Taxa sind Bestandteile des gesunden oralen Kernmikrobioms (eHOMD https://www.homd.org, abgerufen am 01.11.2023). Das Vorkommen von Treponema spp. und Tannerella spp., die zu den „Rotkomplex“-Bakterien gehören, wird auch anhand des Proteoms bestätigt. Weitere potenziell interessante Bakterien sind Aggregatibacter spp., Cardiobacterium spp. und Eikenella corrodens, regelmäßige Bestandteile eines gesunden Mikrobioms, die aber in seltenen Fällen die Ursache einer infektiösen Endokarditis sein können42.

Aus einem Backenzahn von SLB wurde alte DNA extrahiert, um die endogene DNA-Persistenz zu testen und ein genetisches Profil des Individuums zu erstellen. Die Extrakte wurden in einzelsträngige Genombibliotheken umgewandelt und für insgesamt 531 Millionen Lesevorgänge auf der Illumina HiSeq-X Ten-Plattform sequenziert. Die entnommene endogene DNA ergab eine genomweite Abdeckung von 0,24X, wobei > 290.000 SNPs das 1240 K – Human Origins SNP Array v54.1 (https://reich.hms.harvard.edu/allen-ancient-dna-resource) überlappten -aadr-downloadable-genotypes-present-day-and-ancient-dna-data). Die Desaminierungsmuster zwischen den Sequenzen stimmten mit dem Alter der Probe überein (Ergänzungstabelle S4), und das Vorhandensein einer modernen Kontamination wurde sowohl auf X-Chromosom- (6 %) als auch auf Mitochondrienebene (2 %) ausgeschlossen (Ergänzungstabelle S4). . Aus dem Individuum wurde ein 39-faches vollständiges mitochondriales Genom rekonstruiert, das im Vergleich zum rCRS 33 einzigartige Varianten ergab. Die mitochondriale Haplogruppe wurde mit einer Genauigkeit von 99 % der Haplogruppe K1a + 195 zugeordnet. Die Y-Chromosomen-Haplogruppe wurde als G2a2a1 identifiziert, indem hochwertige SLB-Reads mit einer informativen Liste von Y-Chromosomen-SNPs verglichen wurden (https://isogg.org/tree/). Sowohl das X/Autosomen-Abdeckungsverhältnis als auch das Y/Geschlechtschromosomen-Abdeckungsverhältnis lassen darauf schließen, dass es sich bei der Person um einen Mann handelte, was das Ergebnis der anthropologischen Untersuchung bestätigt. Ein phylogenetischer Baum (Abb. 4a) wurde rekonstruiert, um die Häufung des Individuums in der Landschaft prähistorischer K-bezogener Mitochondrienlinien und SLB-Cluster in der Nähe anderer K1a + 195, insbesondere eines Individuums aus der neolithischen Siedlung Makotrasy, zu untersuchen (I14173, Baalberge-Kultur, Tschechische Republik) datiert auf 4300–3500 v. Chr. Interessanterweise zeigt das für die mitochondriale Variabilität durchgeführte MJN, dass SLB nur wenige Knoten von einem anderen K1-verwandten prähistorischen Individuum aus Italien, dem Iceman, entfernt ist, dessen seltene mitochondriale Haplogruppe nur im Alpengebiet identifiziert wurde (ergänzende Abbildung S5).

(a) Die phylogenetische Rekonstruktion alter K-bezogener mitochondrialer Abstammungslinien zeigt, dass SLB in die Variabilität der Haplogruppe K1a + 195 (olivgrün) fällt. (b) PCA-Projektion von SLB-Individuen in die Variabilität des antiken italienischen und mediterranen Neolithikums; (c) die Verteilung der G2a-verwandten Y-Chromosomenlinien im alten Europa zwischen 8000 und 2500 v. Chr. (links) und 2500 v. Chr. – 1500 n. Chr. (rechts). SLB wird in einem roten Quadrat angezeigt. Genomdaten stammen aus dem David Reich Lab Allen Ancient DNA Resources v54.1. Die Karten wurden vom National Geologic Map Database-Projekt (https://ngmdb.usgs.gov/topoview/) bezogen und mit Adobe Illustrator 2022 v3.0 (verfügbar unter https://www.adobe.com/products/illustrator/) angepasst. ); (d) Bei der Projektion auf die Variabilität der modernen Italiener gruppiert sich der SLB (blauer Punkt) in unmittelbarer Nähe der modernen Süditaliener (gelbe Punkte), überschneidet sich jedoch nicht mit ihnen.

Unter einer diachronen und geografischen Bevölkerungsperspektive verglichen wir unsere Stichprobe mithilfe der Hauptkomponentenanalyse mit antiken und modernen Populationen. Die PCA-Projektion auf einen Datensatz antiker Proben zeigt, wie SLB in die Variabilität der neolithischen Individuen des italienischen und mediterranen Neolithikums, des nahen Peloponnes und des anatolischen Neolithikums fällt (Abb. 4b).

Das SLB-Individuum wurde dann auf einen Datensatz von 737 modernen Italienern projiziert (Abb. 4d), der repräsentativ für die genetische Variabilität Italiens ist (siehe Abschnitt „Material und Methoden“) und mit unveröffentlichten Genomdaten von 20 modernen Einwohnern der nahegelegenen Gemeinde zusammengeführt von San Lorenzo Bellizzi. Die geografische Häufung der Proben zeigt einen deutlichen Breitengradienten entlang der Halbinsel, wobei der sardische Cluster deutlich vom Rest getrennt ist. Die modernen Bewohner von San Lorenzo Bellizzi gruppieren sich in unmittelbarer Nähe zur süditalienischen Kontrollgruppe, überschneiden sich jedoch nicht mit dieser; Stattdessen scheinen sie vom Rest der modernen Proben getrennt zu sein, was auf eine mögliche Isolierung und einen daraus resultierenden genetischen Drifteffekt hinweist. Trotz der geografischen Nähe fällt das neolithische SLB-Individuum weder in die Variabilität moderner Gruppen, noch in die der modernen Bewohner von San Lorenzo Bellizzi, noch in die genetische Variabilität des Südens.

Die Grotta di Pietra Sant'Angelo liegt in beträchtlicher Höhe auf einem senkrechten Felsen, der äußerst schwer zu erreichen ist. Trotz der vielen Hohlräume, die im Bereich des Felsmassivs untersucht wurden, ist dies der einzige, in dem bisher neolithische Grabaktivitäten festgestellt wurden. Die typologischen Merkmale der in der Höhle gefundenen Bestattung machen sie zu einem bemerkenswerten Fund für die Vorgeschichte Süditaliens. Ähnliche Arten der Bestattung, bei der eine einzelne Person in Bauchlage und zusammengekauert mit dem Gesicht zum Boden gerichtet begraben wird, finden sich in Palata di Canosa44, Pulo di Molfetta45 und Titolo di Bari-Palese9, drei apulischen Stätten aus der Antike und Mittelneolithikum. Es muss jedoch beachtet werden, dass diese Bestattungen in typischen Bestattungskontexten innerhalb oder in der Nähe der Dörfer stattfinden. Wenn man (1) die allgemeineren typologischen Beweise für die Bestattung des Verstorbenen in einer zusammengekauerten Position innerhalb der Grube, (2) das weit verbreitete Vorhandensein von Abdecksteinen und (3) das völlige Fehlen von Grabbeigaben berücksichtigt, können weitere Ähnlichkeiten mit gefunden werden das Kindergrab der Grotta di San Michele in Saracena46 und im Grabbereich des neolithischen Dorfes Favella3. Die sozialen Bedeutungen, die dem in der Grotta di Pietra Sant'Angelo zum Ausdruck gebrachten heterodoxen Bestattungsverhalten zugrunde liegen, sind jedoch schwer zu klären. Im Vergleich zu anderen ähnlichen archäologischen Stätten im nördlichen Ionischen Kalabrien, wie den nahegelegenen Höhlen von Cassano allo Ionio47, deutet das Fehlen weiterer menschlicher Überreste darauf hin, dass die Grotta di Pietra Sant'Angelo im Mittelneolithikum eine untergeordnete Rolle als Grabstätte spielte. Darüber hinaus lässt die extreme Kontraktion des Körpers in der Grube zwei Interpretationsszenarien vermuten: eine kritische Gebrechlichkeit des Subjekts, die eine leichte Beugung der unteren Gliedmaßen hätte ermöglichen können; das mögliche Vorhandensein von Seilen, die die Gliedmaßen zusammenhielten. Die Anordnung des Körpers mit seinen gesamten Umfang bedeckenden Steinen könnte mit dem praktischen Ziel verbunden sein, den Körper in der Liegeposition zu fixieren. Darüber hinaus könnte die völlig unnatürliche Stellung der oberen Gliedmaßen und der Hände auch darauf hindeuten, dass der Leichnam während der Bestattung, entweder kurz vor dem Tod oder in einer späteren Phase von mindestens 24–36 Stunden, in eine solche Stellung gebracht wurde , also die notwendige Zeit, bis die Totenstarre aufhört48. Trotz des Fehlens anthropologischer Elemente, die in direktem Zusammenhang mit der Todesursache stehen könnten, ermöglichen uns mehrere Skelettmerkmale, die durch makroskopische Untersuchungen identifiziert wurden, einige Überlegungen zum Lebensstil des Individuums. Die Analyse des postkraniellen Skeletts liefert Informationen zu akuten oder wiederholten mittelschweren Mikrotraumata an den Schultern (Verdacht auf Grünholzfraktur, Enthesopathien), den oberen Gliedmaßen (Osteophyten, Osteochondritis dissecans, Enthesopathien), dem Beckengürtel und den unteren Gliedmaßen (Osteophyten, Periostitis, Osteochondritis). dissecans). Diese Veränderungen könnten mit einer allgemeinen biomechanischen Belastung von Knochen und Gelenken zusammenhängen, die auch periphere aspezifische Knochenentzündungen in den unteren Gliedmaßen hervorrufen könnte29,49. Darüber hinaus wurden die beidseitigen Kniebeugen von Schienbein und Talus sowie die Neigung des Schienbeinplateaus nach hinten als Anzeichen für eine Hyperflexion an den Hüft- und Kniegelenken und eine Hyperdorsalflexion an den Sprung- und Subtalargelenken gewertet; Diese Gelenkmarker stehen im Zusammenhang mit der gewohnheitsmäßigen Nutzung der Hockstellung während des Lebens sowie mit längerem Stehen und Gehen auf harten/undurchlässigen Oberflächen50,51,52 und/oder mit genetischen Merkmalen53. Insgesamt deutet der stressbedingte Umbau des Skeletts, an dem verschiedene Knochen in moderater Weise beteiligt sind, darauf hin, dass eine Vielzahl wiederholter körperlicher Aktivitäten eine Rolle im Lebensstil des Einzelnen gespielt haben könnte. Die Analyse der Zahnabnutzung liefert Hinweise auf die Nutzung des Mundes für nicht-ernährungstechnische Zwecke, als unspezifisches Werkzeug oder „dritte Hand“. Die extremen Abnutzungsmuster der unteren Schneidezähne und das Vorhandensein von Mikrorillen auf den Kauflächen wurden als Beweis für extrakauende Aktivitäten gewertet und die Verringerung der Zahngröße wurde in der Literatur als Ergebnis der kombinierten Effekte von beschrieben okklusaler und interproximaler Verschleiß54,55. An den Seitenzähnen wurden Zahnabnutzungsmuster vom Kautyp beobachtet, die auf Reibung und Abrieb zurückzuführen sind, auch wenn die asymmetrische Abnutzung (stärker auf der rechten Seite) ein diagnostisches Element sein könnte, das mit Aktivitäten wie der Zubereitung von Nahrungsmitteln oder der Verarbeitung von harten Lebensmitteln zusammenhängt oder widerstandsfähige Materialien. Darüber hinaus bestätigen die durch morphologische Untersuchungen identifizierten Mikrotrümmer die Nutzung des Mundes für nicht-ernährungsphysiologische Zwecke. Es wurden keine diagnostischen Elemente im Zusammenhang mit der Ernährung gefunden, aber das Vorhandensein von magentafarbenen Mineralien und Fasern könnte mit der Verwendung des Mundes als dritte Hand bei der Herstellung von Kunsthandwerksgegenständen in Verbindung gebracht werden. Während es schwierig ist, diese Fasern sicher einer handwerklichen Tätigkeit zuzuordnen, könnten das Vorhandensein deutlicher Zahnabnutzung an den Zähnen von SLB und das Vorhandensein von Fasern ein Hinweis auf ein faserbasiertes Handwerk sein. Solche Beweise wurden in anderen zeitgenössischen Bestattungskontexten in SI, wie Serra Cicora in Apulien, bezeugt und mit der Verwendung des Mundes als Arbeitswerkzeug in Verbindung gebracht10.

Unter den festgestellten Zahnerkrankungen wurden Absplitterungen und Brüche der Zahnkronen als Anzeichen für das Kauen harter Partikel gewertet56,57. Schließlich wurden ein diffuser Rückgang des Alveolarknochens und die Freilegung der Zahnwurzeln mit einer Entzündung des Weichgewebes (Parodontitis, Gingivitis) in Verbindung gebracht58. Diese paläopathologischen Beweise stimmen mit den biomolekularen Daten überein, die aus Zahnstein gewonnen wurden.

Paläoproteomische Analysen des Zahnsteins zeigten das Vorhandensein eines reichhaltigen oralen Mikrobioms, das von Bakterientaxa dominiert wird, die häufig in Plaque und Mundhöhle vorkommen. Die Authentizität nichtmenschlicher Peptidsequenzen, die auf das Vorhandensein von Nahrungsproteinen (z. B. Bos-Taurus-Kollagen) hinweisen könnten, kann nicht sicher nachgewiesen werden und daher wird keine weitere Interpretation versucht. Die Metaproteomdaten stimmen mit den Metagenomanalysen überein und zeigen das Vorhandensein von Actynomyces und Streptococcus sowie von Treponema und Tannerella spp., wobei letztere typisch für Parodontitis sind. Die metagenomische Analyse hat insbesondere die Persistenz der gramnegativen Bakterien Treponema denticola, Tannerella forsythia und Porphyromonas gingivalis hervorgehoben, die zu den sogenannten „Rotkomplex“-Bakterien gehören und bekanntermaßen stark mit Parodontalerkrankungen assoziiert sind32,33, aber auch zu einem höheren Risiko für die Entwicklung von Speiseröhrenkrebs59,60 und Diabetes mellitus61,62 und werden als Risikofaktor für verschiedene andere Syndrome vorgeschlagen63,64. Unter den entdeckten Bakterien von potenziellem Interesse könnten Aggregatibacter spp., Cardiobacterium spp. und Eikenella corrodens, die normalerweise Teil eines „gesunden“ Mikrobioms sind, in seltenen Fällen mit der Entwicklung einer infektiösen Endokarditis in Verbindung gebracht werden42. Das Vorhandensein von Zahnerkrankungen und der Nachweis von Amylasen stehen im Einklang mit dem Verzehr einer kohlenhydratreichen, typisch neolithischen Ernährung. Proteomik kann auch die Immunantwort des Wirts erkennen, und es wurden mehrere menschliche Proteine ​​beobachtet, darunter zahlreiche Komponenten des angeborenen Immunsystems, z. B. die Degranulation von Neutrophilen und antimikrobielle Peptide (ergänzende Abbildung S3). Dies bestätigt auf molekularer Ebene die Tatsache, dass das Individuum im Laufe seines Lebens an Infektionen gelitten hat65,66,67,68.

Aufgrund der schlechten Erhaltung der Überreste während der archäologischen Untersuchung wurde die Person zunächst als weiblich identifiziert4. Allerdings führten alte DNA-Daten und Laboranalysen der Skelettreste zu einer zweifelsfreien Identifizierung des Individuums als Mann und bestätigten damit das Ergebnis einer kürzlich durchgeführten anthropologischen Untersuchung6. Die PCA-Projektion der genetischen Daten auf den Datensatz antiker Proben zeigt, wie SLB in die Variabilität des italienischen und mediterranen Neolithikums in der Nähe des peloponnesischen und anatolischen Neolithikums fällt. Diese neolithische genetische Signatur wird durch die aus SLB gewonnenen uniparentalen Haplogruppen gestützt: Sowohl die K1a-Zweige der mitochondrialen DNA als auch die G2a-Y-Chromosomen-Unterlinien wurden als Teil der neolithischen genetischen Komponente angegeben, die vor 8000 Jahren mit G2a sub den europäischen Kontinent erreichte -Haplogruppen sind die am weitesten verbreiteten uniparentalen Abstammungslinien unter neolithischen Europäern69,70 (Abb. 4c). Im Vergleich zu modernen Populationen verschiebt sich die SLB in die Nähe des sardischen Clusters, von dem berichtet wurde, dass es unter allen italienischen Proben den größten Anteil neolithischer Abstammung aufweist71,72,73,74. Auf der Grundlage moderner Daten wurde vorgeschlagen, dass die genetische Vorgeschichte von SI das Ergebnis anderer Migrationsereignisse als derjenigen ist, die die Abstammung Ost- und Mitteleuropas geprägt haben, wobei genetische Verbindungen zwischen ägäischen Populationen und SI im Mittelmeerraum bis in die Jungsteinzeit zurückverfolgt werden können Zeitraum75,76. Die genetischen Beiträge, die SI mit den griechischen Inseln und Anatolien verbanden, legen die Möglichkeit nahe, dass das Mittelmeer als ergänzender Knotenpunkt für Migrationsereignisse im Neolithikum gedient haben könnte77, auch wenn diese Möglichkeit bei einem einzelnen Individuum aus Kalabrien nicht vollständig erforscht werden kann. Dennoch ist die paläogenomische Landschaft des prähistorischen SI noch lange nicht verstanden, und es sind neue Daten erforderlich, um das Erbe der antiken Migrationen in dieser Region besser zu verstehen. Die in dieser Arbeit präsentierten paläogenomischen Ergebnisse werden sicherlich durch die geringe Anzahl der verwendeten SNPs beeinflusst, sie stellen jedoch einen weiteren wichtigen Schritt für archäomolekulare Studien in den südlichen Regionen der italienischen Halbinsel dar.

Die Ergebnisse einer solchen interdisziplinären Studie ermöglichten es uns, ein nahezu vollständiges bioarchäologisches Profil des Individuums zu rekonstruieren. Ob die in der Grotta di Pietra Sant'Angelo zum Ausdruck gebrachte Bestattungsanomalie mit nekrophoben oder rituellen Praktiken zusammenhängen könnte, lässt sich anhand der Ergebnisse dieser interdisziplinären Forschung nicht klären. Einige der von uns gesammelten Beweise deuten jedoch auf interessante Möglichkeiten hin. Das Fehlen von Traumaspuren auf Skelettresten und das Vorhandensein von Bakterien, die möglicherweise mit entzündlichen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, könnten in Kombination mit dem Nachweis menschlicher Proteine ​​des angeborenen Immunsystems auf das Fortbestehen eines unspezifischen Entzündungszustands mit möglicherweise tödlichen Folgen hinweisen. Die Möglichkeit, dass die Person außerhalb ihrer Gemeinschaft gestorben ist, würde die unorthodoxe Entscheidung erklären, die Person an einem Ort zu begraben, an dem keine spezifischen Leichenhallenfunktionen nachgewiesen wurden. Trotz des Fehlens einer eindeutigen Bestattungsausrüstung könnte die Bestattung selbst als Ausdruck eines sorgfältig geplanten sozialen Verhaltens definiert werden, insbesondere angesichts der Schwierigkeiten, die sich beim Zugang zur Höhle ergeben. Der Beitrag geochemischer Methoden wie der Analyse stabiler Isotope, die in dieser Studie nicht angewendet werden, könnte hilfreich sein, um die Herkunft des Individuums besser zu verstehen. Darüber hinaus hoffen die Autoren, dass in naher Zukunft neue molekulare Daten aus Kalabrien generiert werden können, dessen reiche Vorgeschichte es verdient, durch integrierte Ansätze erforscht zu werden.

Alle für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente entsprechen spezifischen Richtlinien und Vorschriften.

Die Untersuchung der Position der Knochen wurde in situ vor der Ablösung des Skeletts vom Boden gemäß den methodischen Hinweisen von Crubezy et al., 199078 und Duday, 200628, durchgeführt. Eine vorläufige anthropologische Untersuchung6 konzentrierte sich auf die Bewertung biologischer Parameter wie z Sterbealter, Geschlecht und Statur; Anthropologische Daten wurden durch makroskopische morphologische Beobachtung und metrische Untersuchung der Knochen gemäß den wichtigsten in der Literatur beschriebenen Methoden79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89 erfasst.

Eine paläopathologische Analyse des Skeletts wurde durchgeführt, um makroskopische Anomalien an Knochen und Gelenken sowohl im Axial- als auch im Appendikularskelett zu identifizieren und zu beschreiben (ergänzende Abbildung S1). Die paläopathologische Analyse wurde durch direkte Inspektion durchgeführt und eine medizinische Computertomographie (Aufnahmeparameter: 1,25 Schnittdicke, Rekonstruktionsintervall 0,6 mm, 120 kV und 100 mA) wurde an der UO für Radiologie am Morgagni Pierantoni Krankenhaus in Forlì durchgeführt. Zu den visuellen Beurteilungen gehören die Identifizierung pathologischer Läsionen und deren Verteilung innerhalb der betroffenen Knochen und Gelenke sowie eine beschreibende Zusammenfassung der Art der abnormalen Merkmale49. Die deskriptive Analyse kann wichtige Datensätze für eine tiefergehende paläopathologische Forschung liefern.

Eine Mikrodebrisanalyse wurde an Zahnstein durchgeführt, der aus dem ersten rechten unteren Schneidezahn entnommen wurde, wobei das Vorhandensein von Abnutzungserscheinungen auf der Okklusionsfläche auf eine Nutzung des Mundes als „dritte Hand“ hinweisen könnte. Das Protokoll basierte auf früheren Studien65,90. Nach der Extraktion des Zahnsteins und einem Dekontaminationsschritt zur Entfernung von Elementen aus dem Grabboden wurde die Probe in einer schwachen Salzsäurelösung (0,6 M HCl) entkalkt. Dieser Schritt löst die anorganische Matrix auf und extrahiert alle Mikrotrümmer, die im Laufe des Lebens des Individuums in den Zahnstein eingebaut wurden. Die Beobachtung der Mikrotrümmer erfolgte mit einem polarisierenden optischen Mikroskop im Durchlicht. Die Objektträger wurden mit einer Vergrößerung von 160x, 400x, 1000x unter Verwendung eines optischen Mikroskops Leica ICC50 W gescannt. Die Mikrotrümmer (ergänzende Abbildung S2) wurden anhand der Morphologie und eines Namens, einer Beschreibung und einer Hypothese über den Ursprung und die Art des Einbaus in Morphotypen unterteilt. Jede vorgeschlagene Identifizierung basiert auf ihren anatomischen Merkmalen und dem Vergleich mit modernem Referenzmaterial und wichtigen Referenztexten90,91,92,93,94,95,96,97,98,99.

Die Probenvorbereitung für die Paläoproteomik wurde im speziellen Labor für antike Proteine ​​(„Archaeobiomics“) an der Universität Turin durchgeführt, wobei internationale Richtlinien zur Minimierung von Kontaminationen und zur Gewährleistung der Authentizität der Sequenzen befolgt wurden100. Kurz gesagt, die Probe (PALTO 247) wurde gewogen (7,6 mg), zehn Minuten lang in 200 μl Ethylendiamintetraessigsäurelösung (EDTA, 0,5 M, pH = 8) gewaschen und dann in 500 μl 0,5 M EDT unter leichtem Rühren (450 °C) demineralisiert RPM) für acht Tage. Die demineralisierte Probe wurde gemäß dem SP3-Protokoll für Proben mit niedrigem Proteingehalt verarbeitet101. Nach der Reduktion von Disulfidbindungen mit Dithiothreitol (1 M wässrige Lösung) bei 65 °C für 60 Minuten und der Alkylierung mit Iodacetamid (0,5 M wässrige Lösung) bei Raumtemperatur für 45 Minuten wurden 30 μl Sera-Mag SpeedBeads (1:1-Mischung) hinzugefügt (von hydrophob und hydrophil) wurden jedem der Extrakte zugesetzt. Um die Bindung zu induzieren, wurde 100 % EtOH (HPLC-Qualität) bis zu einer EtOH-Endkonzentration von 50 % zugegeben und 5 Minuten lang bei 24 °C und ~ 1000 U/min inkubiert. Anschließend wurden die Röhrchen zur Trennung auf ein Magnetgestell gestellt, der Überstand entfernt und verworfen. Die an die Perlen gebundenen Proteine ​​wurden mit 80 % EtOH (3X) gereinigt, gegen Puffer (50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5–8) ausgetauscht und die Mischung 30 s lang beschallt. Nach diesem Schritt wurde Trypsin (0,5 μg, Promega, Proteomics-Qualität) für den Verdau über Nacht bei 37 °C zugegeben und leicht geschüttelt (~ 1000 U/min). Anschließend wurden die Extrakte 1 Minute lang zentrifugiert, auf ein Magnetgestell gestellt, die Überstände mit den verdauten Peptiden in separate Röhrchen überführt, mit 10 % TFA angesäuert (auf eine TFA-Endkonzentration von 0,1 %) und die Proben mit C18-Feststoff gereinigt -Phasen-Extraktionsspitzen (Pierce, Thermo-Fisher). Eluierte Peptide wurden zur Trockne eingedampft.

Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analysen (LC-MS/MS) wurden am Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, Universität Kopenhagen durchgeführt. Der Zahnsteinprobe (PALTO 247) wurden eine Laborkontrolle (alte Molluskenschale A) und zwei Waschrohlinge vorangestellt, gefolgt von einer Waschblindprobe und einer Laborkontrolle (alte Molluskenschale Kontrolle B). Getrocknete Peptideluate wurden in 30 μl 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril (ACN) in Wasser resuspendiert und bei 40 °C in eine Vakuumzentrifuge SpeedVac™ Concentrator (Thermo Fisher Scientific, Dänemark) überführt, bis etwa 5 μl der Lösung übrig waren . Anschließend wurden 15 μl 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und 5 % ACN in jede Vertiefung gegeben. Die Proben wurden dann auf einer 15-cm-Säule (75 μm Innendurchmesser) aufgetrennt, mit einem hauseigenen Laser gezogen und mit 1,9 μm großen C18-Perlen (Dr. Maisch, Deutschland) auf einem EASY-nLC 1200 (Proxeon, Odense, Dänemark) gepackt, der an eine angeschlossen war Orbitrap Exploris 480 Massenspektrometer (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) bei einem 77-minütigen Gradienten. Vier Mikroliter der Probe/Kontrolle wurden injiziert. Die LC- und MS-Parameter wurden gemäß der Zahnkalkmethode von Scorrano et al.102 ermittelt, mit einer HCD-Kollisionsenergie von 30 %, einer RF-Linse von 40 % und einer MS2-Injektionszeit von 54 ms, um Unterschiede zwischen den Massenspektrometern auszugleichen.

Rohdaten der Massenspektrometrie wurden mithilfe der PEAKS Studio Die Ergebnisse der durchgeführten Spider-Suchen, einschließlich aller möglichen Modifikationen und Aminosäuresubstitutionen, wurden für die weitere Analyse berücksichtigt. Die Schwellenwerte für die Peptid- und Proteinidentifizierung wurden wie folgt festgelegt: Peptid-Score − 10lgP ≥ 30, Protein-Score − 10lgP ≥ 40, De-novo-Sequenz-Scores (ALC%) ≥ 80, eindeutige Peptide ≥ 2. Um sicherzustellen, dass alle Kontaminationsquellen vorhanden waren In Anbetracht dessen basieren die hier diskutierten Ergebnisse auf dem Satz von Proteinen, die nach dem Entfernen aller in den Blindproben und der Kontrolle gefundenen Proteine ​​verbleiben (die ungefilterten Ergebnisse werden im ergänzenden Datensatz angegeben).

Der gesamte Datensatz wurde auch zur Schätzung des Ausmaßes der Desamidierung, sowohl insgesamt als auch standortspezifisch, mit dem DeamiDATE-Tool103 verwendet. Die rohen MS-Daten wurden zunächst mit MaxQuant v.1.6.3.4104 mit einer Datenbank durchsucht, die alle positiven Proteintreffer aus der PEAKS-Suche enthielt. Carbamidomethyl (C) wurde als feste Modifikation festgelegt; Oxidation (M), Desamidierung (NQ), Pyroglutaminsäure (QE) und Hydroxyprolin wurden alle als variable Modifikationen festgelegt. Die Verdauung wurde auf Trypsin mit maximal zwei fehlenden Spaltungen eingestellt. Die Falscherkennungsrate (FDR) wurde auf 1 % festgelegt und der Mindestpunktzahl-Grenzwert für modifizierte und unmodifizierte Peptide betrug 50. Alle anderen Parameter wurden für Orbitrap-Massenspektrometer auf den Standardwerten belassen. Sämtliche Labor- und Handhabungsverunreinigungen wurden aus den Ergebnissen entfernt.

Die Analysen wurden im Ancient DNA Laboratory der Abteilung für Kulturerbe (Universität Bologna) unter Einhaltung strenger Standards für paläogenomische Arbeitsabläufe105,106 durchgeführt. Ein zweiter unterer linker Molar wurde für die Extraktion alter DNA (SLB2) isoliert. Der Zahn wurde gründlich mit 4 % HCl gereinigt, in 80 % EtOH gespült und dann 20 Minuten lang unter UV-Licht sterilisiert. Anschließend wurden 1–2 mm Außenfläche der Wurzel mit einer rotierenden Klinge abgeschliffen, um die oberflächliche Schicht zu entfernen, und 60 mg Zement- und Dentinpulver wurden durch Bohren der Wurzel bei niedriger Geschwindigkeit mit einem Zahnbohrer gesammelt. Für die metagenomische Analyse wurde ein 15-mg-Zahnsteinfragment (SLBT) aus dem zweiten unteren linken Schneidezahn entnommen und nach 20-minütiger UV-Bestrahlung zur DNA-Extraktion auf einen sterilisierten Mörser pulverisiert. Die DNA-Isolierung wurde wie bei Dabney et al. durchgeführt. (2013) mit leichten Labormodifikationen wie bei Cilli et al. (2020)107 und molekulare Konzentrationen wurden mit dem QuBit-Fluorometer gemessen. In jeder Phase der Analyse wurden Blindkontrollen zusammen mit den Proben verarbeitet. Anschließend wurden für beide Extrakte einzelsträngige Bibliotheken erstellt108, in äquimolaren Mengen mit anderen Proben gepoolt und auf der HiSeqX Ten 2 × 150 bp-Spur auf endogene DNA gescreent. Nachdem das Vorhandensein authentischer alter DNA bestätigt wurde, wurde die SLB-Probe ein zweites Mal auf der HiSeqX Ten 2 × 150-bp-Spur sequenziert, wodurch mehr als 500 Millionen Lesevorgänge generiert wurden.

Rohdaten wurden mit Paleomix109 verarbeitet: Die Fastq-Dateien wurden mit AdapterRemoval110 gefiltert, das Adapter entfernte und kürzere Lesevorgänge als 30 bp ermöglichte. Die Lesevorgänge wurden dann separat mit dem Human Reference Genome (GRCh37) und einer verlängerten Version des rCRS unter Verwendung von Circular Mapper v1.93.5 (https://github.com/apeltzer/CircularMapper) und bwa v0.7.17 aln algorithm111, mit Minimum, abgeglichen Mapping-Qualität ≥ 20, Seeds deaktiviert und Parameter − n auf 0,01 gesetzt. PCR-Duplikate wurden automatisch entfernt und die Authentizität der Reads wurde durch die Auswertung der Desaminierungsmuster an beiden Enden der Reads mit mapDamage v2.2.1112 bestätigt. Die Kontamination moderner Menschen wurde anhand von Schmutzi113 bzw. ANGSD v0.939114 auf der Ebene der Mitochondrien und der X-Chromosomen geschätzt. Wir verwendeten Schmutzi, um die Konsensussequenz der mitochondrialen DNA zu generieren, und der Haplogruppe wurden HaploGrep2115 und Haplofind116 zugeordnet. Die Option „Neuskalierung“ von „mapDamage“ wurde verwendet, um die Qualitätswerte wahrscheinlich beschädigter Positionen der Lesevorgänge aufgrund alter DNA-Schäden zu verkleinern. Anschließend wurde eine Liste informativer SNPs für das Y-Chromosom von der International Society of Genetic Geneaology (https://isogg.org/tree/) und der Software yhaplo (https://github.com/23andMe/yhaplo) heruntergeladen. wurde verwendet, um die Y-Chromosomen-Haplogruppe anhand von Lesevorgängen mit Kartierungsqualitätswerten ≥ 30 und Basen mit Qualitätswerten ≥ 30 zu identifizieren. Das biologische Geschlecht des Individuums wurde geschätzt, indem das Verhältnis der Lesevorgänge, die auf das X-Chromosom ausgerichtet waren, als Teil der Gesamtsequenzen berechnet wurde Zuordnung zu den Autosomen mithilfe des R-Skripts von Mittnik et al. 2016117. Die Ergebnisse wurden auch mit dem Geschlechtszuordnungsansatz von Skoglund et al. verglichen. 2013118, das das Verhältnis der Read-Mapping zum Y-Chromosom als Teil der Alignments zu den Geschlechtschromosomen berechnet. Ein phylogenetischer Maximum-Likelihood-Baum wurde mit der Software MEGA Wiederholungen. Das Median Joining Network (ergänzende Abbildung S5) wurde mit der Netzwerksoftware v.10 (www.fluxus-engineering.com) unter Verwendung von Standardparametern für einen Satz von 53 K1a (n = 19), K1a + 150 (n = 3) durchgeführt. , K1a + 195 (n = 30) und K1f. (n = 1) Einzelpersonen (Ergänzungstabelle S6). Poly-C-Strecken, AC-Indels an den Positionen 303–315, 515–524, 16.180–16.193 und die hypervariable Position 16.519 wurden von der phylogenetischen Rekonstruktion ausgeschlossen.

Pseudohaploide Genotypen wurden aus Lesevorgängen mit einer Kartierungsqualität ≥ 30 mithilfe von PileupCaller (https://github.com/stschiff/sequenceTools) aufgerufen, der basierend auf dem 1240-K-Referenzpanel zufällig eine hochwertige Basis (phred-Basisqualitätsbewertung ≥ 30) auswählt. Für den Befehl samtools mpileup wurde eine Mindestbasis- und Kartierungsqualität von 30 Filtern angewendet und pseudohaploide Daten durch zufälliges Aufrufen eines Allels von jeder abgedeckten Site mithilfe des PileupCaller-Skripts generiert. Für die Kontextualisierung von SLB in der Variabilität des antiken Mittelmeerraums wurde ein Datensatz von 905 antiken Individuen aus dem 1240 K – Human Origins SNP Array (https://reich.hms.harvard.edu/allen-ancient-dna-resource-aadr) ausgewählt -herunterladbare-Genotypen-heutige-und-alte-DNA-Daten). Für jede der im Originaldatensatz beobachteten Mittelmeerpopulationen wurden nur Individuen für einen Zeitraum zwischen der Mittelsteinzeit und der Bronzezeit ausgewählt, mit Ausnahme aller Individuen, die als Duplikate, verwandt, kontaminiert und gering besiedelt bezeichnet wurden.

Aus dem HumanOrigins-Datensatz wurde eine repräsentative Gruppe von 1257 modernen Individuen extrahiert, die als Referenzbasis für die PCA-Projektion dienen sollte. Diese enthalten eine geringere Anzahl an Markern (~ 600 K SNPs), haben aber den Vorteil, dass sie alle Populationen gut abdecken und bereits mit den Alten zusammengeführt sind, was das Verfahren vereinfacht und weitere Reduzierungen der Variantenzahl beim Zusammenführen vermeidet. Daher haben wir ein Vergleichspanel von 2162 IND und 431.156 SNPs (Ergänzungstabelle S7) aus antiken und modernen Euro-Mittelmeer-Populationen erhalten. Die Daten des alten SLB wurden dann mit dem benutzerdefinierten Datensatz zusammengeführt, sodass nach weiterer Bereinigung (unter Verwendung eines 200 25 0,4-Filters) insgesamt 92.322 SNPs übrig blieben. Schließlich haben wir die PCA-Projektion der antiken Individuen mit SLB auf die modernen europäischen Mittelmeer-HOs durchgeführt und die resultierenden Diagramme in vier zeitliche Bildschirme unterteilt, nämlich Mesolithikum, Neolithikum, Chalkolithikum und Bronzezeit (ergänzende Abbildung S6).

In diese Studie wurde die Genotypisierung von 20 modernen Einwohnern der nahegelegenen Gemeinde San Lorenzo Bellizzi einbezogen. Alle diese Proben wurden nach den Kriterien der Großeltern und des Nachnamens des Gründers ausgewählt, um eine Abstammung von mindestens drei Generationen in der Region zu gewährleisten und verwandte Personen auszuschließen. Alle Verfahren bezüglich der modernen Proben wurden am 08.04.2013 von der Bioethikkommission der Universität Bologna genehmigt. Alle Spender gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Datenverarbeitung und zu den Projektzielen ab. Die Studie wurde im Einklang mit den ethischen Grundsätzen der WMA-Erklärung von Helsinki für die Forschung an menschlichen Probanden konzipiert und durchgeführt. Speichelproben wurden mit dem Oragene-DNA Self Collection Kit OG500 (DNA Genotek Inc., Ottawa, Ontario, Kanada) gesammelt. Genomische DNA wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert und mit dem dsDNA BR Assay Kit und dem Qubit-Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA) quantifiziert.

Anschließend wurden DNA-Proben im Zentrum für biomedizinische Forschung und Technologie des italienischen Auxologic-Instituts (Mailand, Italien) für die 713.014 SNPs genotypisiert, die im HumanOmniExpress BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) enthalten sind. Die 20 Proben wurden mit 737 bereits veröffentlichten Individuen zusammengeführt, die repräsentativ für die genetische Variabilität entlang der italienischen Halbinsel sowie Sardiniens sind121. Die Zusammenführung wurde mit PLINK v.1.9122 durchgeführt, indem nur autosomale SNPs berücksichtigt wurden, die in den beiden Datensätzen gemeinsam genutzt wurden, wodurch ein neuer Satz von 757 Individuen und 254.709 Varianten entstand. Anschließend wurde eine Standardqualitätskontrolle mit im selben PLINK-Paket implementierten Funktionen durchgeführt, um eine hohe Qualität des resultierenden endgültigen Datensatzes moderner Personen sicherzustellen. Insbesondere wurde das Fehlen von Daten bei allen SNPs und bei einzelnen Personen mit einem Schwellenwert von 0,05 überprüft, sodass 254.614 SNPs und 757 Personen übrig blieben; Die Einhaltung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts wurde ebenfalls überprüft, wobei eine Bonferroni-Korrektur für Mehrfachtests auf den Standardschwellenwert von 0,01 angewendet wurde, sodass der neue Schwellenwert 3,9275e−8 beträgt. Varianten im Kopplungsungleichgewicht wurden auch mithilfe eines Schiebefensteransatzes mit einem Fenster der Größe 500 SNPs, einer Schrittweite von 50 SNPs und einem LD-Schwellenwert von 0,1 getestet. Wenn eine Variante erkannt wurde, wurde sie zufällig aus dem Datensatz entfernt. Die vollständige Qualitätskontrolle ergab 49.586 SNPs und 757 Personen. Schließlich wurde der Datensatz (757 + SLB-Individuum) mit der SmartPCA-Software aus dem EIGENSOFT-Paket unter Verwendung der Option lsqproject: YES auf den modernen genetischen Hintergrund projiziert.

Wir haben HOPS31 zur Charakterisierung des metagenomischen Profils der Shotgun-Reads eingesetzt. Die Sequenzen wurden zunächst mit einer modifizierten Version von MALT123,124 an die Datenbank angepasst. Insbesondere wurde die Datenbank durch Malt-Build unter Verwendung der „repräsentativen“ und „Referenz“-Genome von Bakterien (n = 11.270) und Archaeen (n = 408) erstellt, die am 16. November 2020 von NCBI RefSeq heruntergeladen wurden. Die Lesevorgänge wurden Bakteriengenomen zugeordnet wurden mit dem MaltExtract-Tool extrahiert und mit ihren jeweiligen Referenzgenomen neu ausgerichtet, um Bearbeitungsabstände, Abdeckungsverteilungen und postmortale DNA-Schadensmuster zu bewerten31,125,126. Zu diesem Zweck haben wir MapDamage112 verwendet, um die Desaminierungsraten abzuschätzen. Die Verteilungen des Post-Mortem-Degradations-Scores (PMDS) wurden mit PMDtools127 berechnet. Die Breite und Tiefe der Abdeckung wurden mithilfe von Bedtools128 geschätzt. Bearbeitungsabstände für alle Sequenzen im Vergleich zu ihren Referenzen wurden zur Berechnung des negativen Differenzanteilsscores (−Δ %) verwendet, wie zuvor von Hübler und Kollegen (2019)31 beschrieben. A − Δ % > 0,9 wurde als relevant für eine abnehmende Verteilung im Zusammenhang mit dem alten DNA-Profil angesehen. Taxa mit mehr als 300 zugewiesenen Lesevorgängen, mehr als 50 Lesevorgängen mit PMDS > 1, − Δ % > 0,9 und Mustern des CT-Übergangs bei 5′ wurden als antiken Ursprungs angesehen. Die MALT-Referenzdatenbank wurde mit dem Befehl malt-build und der Auswahl der „repräsentativen“ und „Referenz“-Genome von Bakterien (n = 11.270) und Archaeen (n = 408) aus NCBI RefSeq (16. November 2020) erstellt. Die gleiche Pipeline wurde für einen Datensatz von 114 Zahnsteinen verwendet, die aus früheren Studien35,36 stammten, darunter Neandertaler und Menschen aus verschiedenen Epochen (vor der Landwirtschaft, Jungsteinzeit, vor der Antibiotika-Zeit und moderne Menschen). Sequenzierungsdaten wurden aus dem ENA-Repository (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home) unter den Projektzugangs-IDs PRJEB34569 und PRJEB44313 heruntergeladen. Rohlesevorgänge aus den jeweiligen Repositorys wurden heruntergeladen und die HOPS-Pipeline mit denselben oben aufgeführten Parametern angewendet. Die resultierenden, auf die Sequenzierungstiefe normalisierten Bakterienzahlen wurden zur Durchführung einer PCoA-Analyse mit dem Bray-Curtis-Abstand verwendet.

Es wurde auch ein Screening auf potenzielle bakterielle Krankheitserreger durchgeführt, indem in den Ergebnissen derselben oben beschriebenen HOPs-Pipeline nach spezifischen Spuren ihrer DNA gesucht wurde. Insbesondere suchen wir nach genomischen Spuren von Krankheitserregern, die laut dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) die relevantesten Infektionskrankheiten für die menschliche Gesundheit sind129. Wir haben diejenigen Bakterien ausgewählt, deren Genome in der HOPS-Datenbank enthalten waren: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Borrelia, Brucella, Campylobacter jejuni, Clostridioides difficile, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus, Klebsiella pneumoniae, Legionella, Listeria, Mycobacterium haemophylum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonellen, Serratia marcescens, Shigella, Staphylococcus aureus, Streptococcus gordonii , Streptocossus mutans, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica und Yersinia pestis. Taxa mit mehr als 10 CPM (Lesevorgänge, die mit der spezifischen Referenz pro Million sequenzierter Lesevorgänge übereinstimmen) wurden der gleichen Analyse unterzogen, wie oben beschrieben (negative Anteilsbewertung, Abdeckungsverteilungen und postmortale DNA-Schadensmuster31,125,126), um ihr Alter zu validieren Herkunft.

Alle während der aktuellen Studie erstellten oder analysierten Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Rohe genetische Daten von Zähnen und Zahnstein sind im Europäischen Nukleotidarchiv unter der Projektzugangsnummer PRJEB58818 hinterlegt. Das rekonstruierte mitochondriale Genom von SLB wurde in der GenBank unter der Zugangsnummer OQ301533 verfügbar gemacht. Die Datensätze antiker Proteine, die aus Zahnstein entdeckt wurden, wurden über das Partner-Repository Proteomics Identifications Database (PRIDE) mit der Kennung PXD039654 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt [Benutzername: [email protected]; Passwort: iFHQ4lrk]. Die Skelettreste werden im Speläoarchäologischen Forschungszentrum von San Lorenzo Bellizzi (CS) aufbewahrt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Leonardo Larocca, dem medizinischen Beamten von San Lorenzo Bellizzi, der die Forschung an den modernen Bewohnern überwachte, und Dr. Andrea De Giovanni, der bei den Probenahmeprozessen half. Ein besonderer Dank gilt der Bevölkerung von San Lorenzo Bellizzi, dem Bürgermeister und der Verwaltung der Gemeinde, deren Einsatz und untrennbare Verbundenheit mit ihren Wurzeln diese Studie ermöglicht haben. Diese Arbeit wird durch das MIUR-PRIN 20177PJ9XF-Stipendium an DL unterstützt.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Elisabetta Cilli und Donata Luiselli.

Abteilung für Kulturerbe, Universität Bologna, Via Degli Ariani 1, 48121, Ravenna, Italien

Francesco Fontani, Mirko Traversari, Adriana Latorre, Rocco Iacovera, Paolo Abondio, Elisabetta Cilli und Donata Luiselli

Abteilung für Biowissenschaften und Systembiologie, Universität Turin, Via Accademia Albertina 13, 10123, Turin, Italien

Rosa Boano, Alessandra Cinti, Beatrice Demarchi, Sarah Sandron und Meaghan Mackie

Abteilung für Pharmazie und Biotechnologie, Universität Bologna, Via Belmeloro 6, 40126, Bologna, Italien

Simone Rampelli & Marco Candela

Abteilung für Biologie, Geologie und Umweltwissenschaften, Universität Bologna, Via Selmi 3, 40126, Bologna, Italien

Paolo Abondio & Stefania Sarno

Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, Zentrum für Proteinforschung der Novo Nordisk Foundation, Universität Kopenhagen, Blegdamsvej 3B, 2200, Kopenhagen, Dänemark

Meaghan Mackie

Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, The Globe Institute, Universität Kopenhagen, Øster Farimagsgade 5, 1353, Kopenhagen, Dänemark

Meaghan Mackie und Matthew Collins

School of Archaeology, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irland

Meaghan Mackie und Anita Radini

McDonald Institute for Archaeological Research, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge, CB2 3ER, Großbritannien

Matthew Collins

SIOF – Italienische Gesellschaft für forensische Odontologie, Strada Degli Schiocchi 12, 41124, Modena, Italien

Chantal Milani

Radiologieabteilung, Krankenhaus Morgagni-Pierantoni, AUSL Romagna, Via Carlo Forlanini 34, 47121, Forlì, Italien

Enrico Petrella und Emanuela Giampalma

Abteilung für Geistes-, Bildungs- und Sozialwissenschaften, Universität Molise, Via Francesco De Sanctis, 86100, Campobasso, Italien

Antonella Minelli

Speläo-Archäologische Forschungsgruppe, Universität Bari, Piazza Umberto I 1, 70121, Bari, Italien

Fröhliches Larocca

Speläoarchäologisches Forschungszentrum „Enzo dei Medici“, Via Lucania 3, 87070, Roseto Capo Spulico (CS), Italien

Fröhliches Larocca

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DL, EC und FL hatten die ursprüngliche Idee; FF, EC, AL, Sa.S., MM, AR, EP, EG und MT führten die Experimente durch; FF, RB, AC, BD, SR, MT, PA, RI, St.S., MM, AR und CM analysierten die Daten; FF hat das Originalmanuskript mit Beiträgen aller Autoren verfasst; AM, M.Ca. und M.Co. half bei der Überwachung des Projekts; Alle Autoren haben die eingereichte Version des Manuskripts überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Francesco Fontani oder Donata Luiselli.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fontani, F., Boano, R., Cinti, A. et al. Bioarchäologische und paläogenomische Profilierung der ungewöhnlichen neolithischen Bestattung in der Grotta di Pietra Sant'Angelo (Kalabrien, Italien). Sci Rep 13, 11978 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39250-y

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 24. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39250-y

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