Mitochondriale Komplex-III-Aktivität: von invasiven Muskelbiopsien bis zum Patienten

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9638 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine medikamenteninduzierte mitochondriale Dysfunktion ist eine häufige Nebenwirkung, insbesondere bei Statinen – den weltweit am häufigsten verschriebenen Medikamenten. Es wurde gezeigt, dass diese Medikamente den Komplex III (CIII) des mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungsprozesses hemmen, der mit Muskelschmerzen zusammenhängt. Da Muskelschmerzen die häufigste Beschwerde von Statinkonsumenten sind, ist es wichtig, sie von anderen Ursachen für Myalgie zu unterscheiden, um ein unnötiges Absetzen der medikamentösen Therapie zu verhindern. Allerdings erfordert die Diagnose der CIII-Hemmung derzeit Muskelbiopsien, die invasiv und für Routinetests nicht praktikabel sind. Weniger invasive Alternativen zur Messung der mitochondrialen Komplexaktivitäten stehen bisher nur für Komplex I und IV zur Verfügung. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der katalytischen CIII-Aktivitäten mithilfe von Mundschleimhautabstrichen, die wir in einer Kohorte von Statin- und Nicht-Statin-Anwendern validiert haben. Unsere Daten deuten darauf hin, dass CIII in Mundschleimhautabstrichen zuverlässig gemessen werden kann, was durch reproduzierbare Ergebnisse oberhalb der Nachweisgrenze belegt wird. Eine weitere Validierung in einem groß angelegten klinischen Umfeld wird empfohlen.

Mitochondriale Myopathie ist typischerweise durch morphologisch und biochemisch beeinträchtigte Mitochondrien gekennzeichnet, was zu einer verminderten Energieproduktion führt. Diese Anomalien haben meist einen genetischen Ursprung, viele Medikamente können jedoch auch eine mitochondriale Dysfunktion auslösen, wofür Statine ein klares Beispiel sind1.

Statine sind mit über 180 Millionen Anwendern weltweit die am häufigsten verschriebenen Medikamente zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ihre Verwendung ist jedoch auch mit verschiedenen Nebenwirkungen verbunden2,3. Bei 7–29 % aller Anwender werden Muskelbeschwerden gemeldet, die von gewöhnlicher Muskelsteifheit bis hin zu seltenen lebensbedrohlichen Fällen von Rhabdomyolyse2,4,5,6 reichen. Wir haben zuvor gezeigt, dass Statine den Mitochondrienkomplex III (CIII)7 hemmen und die CIII-Aktivität umgekehrt mit der Muskelschmerzintensität bei symptomatischen Statinanwendern korreliert8. Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die CIII-Aktivität zur Identifizierung statininduzierter Muskelsymptome (SAMS) nützlich sein könnte, da derzeit kein objektiver oder definitiver diagnostischer Test existiert9,10,11. Es gibt viele verschiedene Definitionen für SAMS und variable Protokolle, die testen, wie wahrscheinlich Muskelbeschwerden durch Statine verursacht werden. Diese beruhen auf subjektiven Fragebögen (z. B. SAMS-CI) oder (indirekten) Laboranomalien (z. B. signifikant erhöhte CK- oder Leberenzymwerte)10,11,12,13,14,15. Ein spezifischerer Test zur Identifizierung von SAMS wäre von besonderem Interesse im Zusammenhang mit der kürzlich veröffentlichten Metaanalyse, die darauf hindeutet, dass die meisten gemeldeten Muskelbeschwerden nicht auf die Verwendung von Statinen zurückzuführen sind16. Andere Faktoren wie Komorbiditäten (z. B. Hypothyreose, rheumatische Polymyalgie, Vitamin-D-Mangel), kürzliche intensive körperliche Aktivität oder Traumata, Virusinfektionen und Polypharmazie können nachweislich Muskelschmerzen hervorrufen und sollten von den Schmerzen, die durch die Einnahme von Statinen verursacht werden, unterschieden werden12,15,17 ,18,19. Diese Unterscheidung ist besonders wichtig, da die Nichteinhaltung einer Statintherapie eine hohe Belastung für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität darstellt11.

Die katalytische Aktivität von CIII wird wie bei anderen Komplexen des oxidativen Phosphorylierungssystems (OXPHOS)20,21 typischerweise durch kolorimetrische Messungen in Muskelbiopsien oder Zellfraktionen22 bestimmt. Muskelbiopsien stellen eine erhebliche Belastung für das Subjekt dar23 und eine weniger invasive Alternative zur Messung der Komplex-I- und IV-Aktivität ist die Durchführung spektrophotometrischer und Immunocapture-Assays in Zellen, die aus Wangenabstrichen gewonnen wurden24,25,26,27. Die letztere Methode scheint eine gute Korrelation mit traditionelleren Methoden zu zeigen, wobei R2 für Aktivitätsmessungen von Komplex I und IV im Bereich von 0,49 bis 0,99 liegt24,25,26,27. Allerdings fehlt ein ähnlicher Test für CIII. Hier haben wir eine Methode zur Messung der CIII-Aktivität basierend auf der enzymatischen Cytochrom-C-Reduktion28 angepasst und validiert, sodass sie in Spektrophotometer-Mikroplatten-Lesegeräten unter Verwendung nicht-invasiver Wangenabstrichproben verwendet werden kann. Die Sensitivität und Validität dieser Messung wurde an einer großen Gruppe von Kontrollpersonen und Statinkonsumenten mit und ohne Muskelbeschwerden getestet.

Im ersten Aufbau wurde die CIII-Aktivität in Wangenabstrichen von Personen ohne CIII-Mangel mittels eines enzymatischen Cytochrom-C-Reduktionsassays gemessen, der spektrophotometrisch in einer 96-Well-Platte gemessen wurde. Dieser Test basierte auf den vorläufigen Daten der ergänzenden Abbildung 1. Durch Zugabe des CIII-Inhibitors Antimycin A (AA) wurde die von diesem Komplex (Hintergrund) unabhängige Cytochrom-C-Reduktion gemessen. Aufgrund des geringen Probenvolumens im Vergleich zu den größeren Vertiefungen führte dies zu CIII-Aktivitäten mit einem hohen Maß an inter- und intraexperimenteller Variabilität (Ergebnisse nicht gezeigt). Daher wurden HeLa-Zellen kultiviert, um auf kontrolliertere Weise Verdünnungsreihen mit Mitochondrien zu erstellen, die zwischen den verschiedenen Experimenten konstanter gehalten wurden. Die HeLa-Verdünnungsreihe zeigte einen allmählichen Rückgang der CIII-Aktivität mit abnehmender Zellzahl, während der Hintergrund (basale Cytochrom-C-Reduktion) derselbe blieb (Abb. 1) und mit geringen Schwankungen innerhalb der Proben. Bei einer fünffachen Verdünnung (ca. 0,25 Millionen Zellen) flachte die Kurve ab (siehe vergrößerter Teil von Abb. 1) und erreichte die Nachweisgrenze des Tests. Die im Mundschleimhautabstrich gemessene CIII-Aktivität war ähnlich wie bei siebenfach verdünnten HeLa-Zellen (ca. 62.500 Zellen/Probe) und lag somit außerhalb der Nachweisgrenze.

CIII-Aktivität in Verdünnungsreihen von HeLa-Zellen im Vergleich zu Mundschleimhautabstrichproben einer Person ohne CIII-Mangel aufgrund fehlender Symptome. Die CIII-Aktivität ausgedrückt in mU mL−1; Mittelwert ± SEM mit aufgezeichneten einzelnen Datenpunkten. Die Verdünnungsreihen für HeLa-Zellen stammen aus einem Fläschchen, die Anzahl der Zellen (in Millionen) ist auf der x-Achse dargestellt. Wie bereits erwähnt wurde eine Probe von vier Abstrichtupfern verwendet. AA (Antimycin A, hellblau) war die gehemmte oder basale Cytochrom-C-Reduktionskapazität für jede Erkrankung. Wenn die konzentrationsabhängige Kurve ein Plateau erreichte, wurden die Messungen als gleichwertig mit dem Hintergrund (= etwa 62.500 Zellen) angesehen.

Die Verdünnungsreihe der HeLa-Zellen zeigte, dass der CIII-spektrometrische Enzymaktivitätstest etwa in der Plateauphase von 62.500 Zellen/Probe ungenau wird. Da die CIII-Aktivität in Mundschleimhautabstrichen etwa in diesem Bereich lag und daher unzuverlässig war, wurden Fluoreszenzmessungen eingesetzt, um die Genauigkeit bei niedrigeren Nachweisgrenzen zu verbessern. Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse der CIII-Aktivität in einer Verdünnungsreihe von HeLa-Zellen, die die Reduktion von Cytochrom C mit Fluoreszenz misst. Die ermittelte Steigung kreuzt die x-Achse um 4–5 Millionen HeLa-Zellen, was darauf hindeutet, dass alles unterhalb dieses Niveaus ungenau ist. Die Abstriche von Personen ohne CIII-Mangel (nicht abgebildet) hatten eine CIII-Aktivität vergleichbar mit 0,5–1 Million HeLa-Zellen. Um die Nachweisgrenze weiter zu verbessern, wurde aufgrund des begrenzten Zellgehalts in den Mundschleimhautabstrichen das Verhältnis zwischen Reaktionsmischung und Mitochondriengehalt erhöht. Um zu vermeiden, dass in jeder Vertiefung zu wenig Volumen vorhanden ist (< 100 µL), wurde auch die Vertiefungsgröße reduziert. Die Erhöhung des zellulären und mitochondrialen Anteils (von 1:2 auf 1:1) durch Verwendung einer 384-Well-Platte führte zu einer linearen Beziehung zwischen der CIII-Aktivität und der HeLa-Zellverdünnungsreihe (Abb. 2B). Eine ähnliche Reaktion wurde für CIII-Aktivitäten in biologisch unabhängigen Replikaten beobachtet (Abb. 2C).

Fluoreszenz- und spektrophotometrische CIII-Aktivitäten in HeLa-Verdünnungsreihen. Fluoreszenzmessung in 96-Well-Platte (A) und 384-Well-Platte (B,C) und spektrometrische Messungen in 384-Well-Platte (D) der HeLa-Zellverdünnungsserie (in Millionen Zellen) und Abstrichprobe von vier gepoolten Abstrichen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Schwarze Linien sind die durch alle Punkte gezogenen linearen Regressionskurven. Verdünnungen (in Millionen HeLa-Zellen) unterhalb des Schnittpunkts dieser Regressionslinie und der x-Achse stellen den minimalen Arbeitsbereich dar. Die rot gestrichelte Linie ist der Grad der CIII-Aktivität für eine Abstrichprobe einer Person ohne CIII-Mangel. Wenn sich diese Linie mit der Regressionslinie über dem Schnittpunkt mit der x-Achse schneidet, wurde davon ausgegangen, dass die Ergebnisse über der Nachweisgrenze des Tests liegen.

Da der CIII-Inhibitor AA, der zur Blockierung der enzymatischen Cytochrom-C-Reduktion notwendig ist, autofluoreszierende Eigenschaften aufwies (Daten nicht gezeigt), wechselten wir wieder zum spektrophotometrischen CIII-Assay. Um die Mitochondrienkonzentration zu erhöhen, wurde eine 384-Well- statt einer 96-Well-Platte gewählt (Abb. 2D). Ergebnisse aus drei biologisch unabhängigen Experimenten zeigten eine konzentrationsabhängige CIII-Aktivität, vergleichbar mit dem Fluoreszenzassay (Abb. 3). Auch die Ergebnisse der Mundschleimhautabstrichproben von Personen mit nicht-defizientem CIII lagen in allen drei Experimenten deutlich über der Nachweisgrenze (CIII-Aktivität oberhalb der Plateauphase in HeLa-Zellen).

CIII-Aktivitäten in HeLa-Verdünnungsreihen in einer 384-Well-Platte, gemessen mit Spektrophotometrie. Spektrophotometrische Messungen der HeLa-Zellverdünnung (in Millionen Zellen) und vier als Abstrichprobe gepoolte Abstriche in einer 384-Well-Platte. Gepoolte Ergebnisse von drei biologisch unabhängigen Experimenten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei einzelne Datenpunkte aufgezeichnet werden. Die Abstrichprobe fällt in den Arbeitsbereich des Tests, wenn der Balken über den niedrigsten Werten von HeLa-Zellen liegt, die nach zunehmenden Verdünnungen keinen weiteren Rückgang der CIII-Aktivität zeigten (Hintergrund ab Verdünnung 0,333).

Der Inter- und Intra-Assay-Variationskoeffizient (CV) für die HeLa-Zellen betrug 33,7 % bzw. 26,5 %. Der Intra-Assay-VK für Abstriche entsprach dem von HeLa-Zellen (32,5 %). Allerdings war der Inter-Assay-VK für Mundschleimhautabstriche recht hoch (61,9 %) (Abb. 4). Diese Variabilität wurde durch Messungen der Citrat-Synthase (CS) korrigiert, einer bewährten Methode zur Anpassung an die Variabilität der Zellzahl und des Mitochondriengehalts aus Mundabstrichen23,24,29. Nach CS-Korrektur verringerte sich der Inter-Assay-VK für Wangenabstriche auf 44,7 %. Die Korrektur der Proteinwerte mit dem Bradford-Assay oder dem Pierce™ BCA-Proteinkit (Thermofisher) war schlechter als CS und wurde daher nicht weiter angewendet (Ergebnisse nicht gezeigt)30,31.

Variationskoeffizient für spektrophotometrische CIII-Aktivitäten in HeLa-Zellen und -Tupfern. Spektrophotometrische Messungen der CIII-Aktivität von HeLa-Zellen und Abstrichproben (a unkorrigiert) und korrigiert für die Citrat-Synthase-Aktivität in Abstrichproben (b). Die Ergebnisse stammen aus drei Einzelexperimenten (N = 1–3) und wurden gepoolt (Mittelwert). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei einzelne Datenpunkte aufgezeichnet werden. Der Variationskoeffizient (CV) zwischen den Tests wird angezeigt. CS-Citrat-Synthase.

Die CIII-Aktivität wurde bei 69 Teilnehmern untersucht, die eine Statinbehandlung erhielten, mit (n = 35) und ohne Muskelbeschwerden (n = 34) sowie bei Kontrollpersonen ohne Statin (n = 31). Dreizehn Teilnehmer wurden aufgrund einer nicht messbar niedrigen CIII-Aktivität ausgeschlossen, darunter neun Statinkonsumenten (drei symptomatisch und sechs asymptomatisch) und vier Kontrollpersonen. Die Ausgangsmerkmale der verbleibenden 87 Teilnehmer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die symptomatischen Statinkonsumenten waren im Vergleich zur Kontrollgruppe und den asymptomatischen Statinkonsumenten signifikant jünger (p = 0,022). Alle anderen Ausgangsmerkmale waren zwischen den Gruppen ähnlich.

Die um CS korrigierten mittleren CIII-Aktivitäten unterschieden sich nicht zwischen Statinkonsumenten und Kontrollpersonen (jeweils 900 ± 80 gegenüber 750 ± 130 mU U−1 CS; p = 0,326). Es gab auch keinen Unterschied in der CS-korrigierten CIII-Aktivität zwischen symptomatischen und asymptomatischen Statinkonsumenten (jeweils 910 ± 110 und 890 ± 130 mU U−1 CS; p = 0,930), und es wurde kein Unterschied zwischen der Statingruppe und der Kontrollgruppe beobachtet ( jeweils p = 0,362 und p = 0,442) (Abb. 5a,b). Die CS-Aktivität unterschied sich nicht signifikant zwischen Kontroll- und Statinkonsumenten (sowohl symptomatisch als auch asymptomatisch) (Abb. 5c, d). Allerdings korrelierte die CIII-Aktivität signifikant mit der CS-Aktivität (p < 0,001, r = 0,565).

Die CS-Aktivität korrigierte die CIII-Aktivität und die CS-Aktivität in Wangenabstrichproben von Teilnehmern der Nijmegener Viertagemärsche. (a) CIII und (c) CS bei mit Statinen behandelten Patienten (n = 60) und Kontrollen (n = 27) und (b) CIII und (d) CS bei Statinanwendern mit Muskelbeschwerden (n = 32), ohne Beschwerden (n = 28) und Nicht-Statin-Benutzer (n = 27). Die Aktivität wurde als Absorption der Cytochrom-C-Reduktionsreaktion gemessen und durch Citrat-Synthase-Aktivität (CS) oder als CS-Aktivität allein normalisiert. Es wurden keine statistischen Unterschiede festgestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei einzelne Datenpunkte aufgezeichnet werden.

Statininduzierte Muskelbeschwerden sind ein wichtiger Grund für das Absetzen von Statinen und scheinen mit einer mitochondrialen Dysfunktion verbunden zu sein, die auf eine statininduzierte CIII-Hemmung zurückzuführen sein könnte2,7,32. Die derzeitige Beurteilung von Defiziten oder Hemmungen des Mitochondrienkomplexes erfordert invasive Muskelbiopsien33,34. Neue nicht-invasive Ansätze zur Untersuchung komplexspezifischer mitochondrialer Dysfunktionen werden derzeit erforscht24,26. Mundschleimhautabstriche wurden verwendet, um Veränderungen der Aktivitäten der Mitochondrienkomplexe I und IV nach einer medikamentösen Behandlung zu messen. Daher haben wir ein Testprotokoll für einen mitochondrialen CIII-Funktionstest mithilfe von Mundschleimhautabstrichen entwickelt, das in einer Population mit und ohne Statin-induzierten Muskelbeschwerden validiert wurde.

Die anhand von Mundschleimhautabstrichen von Personen mit nicht symptomatischem CIII-Mangel gemessene CIII-Aktivität führte zu konsistenten Ergebnissen oberhalb der Nachweisgrenzen des Tests (> 0,2 mU mL−1). Diese Nachweisgrenze basierte auf CIII-Messungen aus Verdünnungen kontrollierter HeLa-Zellzahlen. Er wurde knapp über den niedrigsten CIII-Werten eingestellt, die keinen weiteren Rückgang der CIII-Aktivität zeigten (was eine Hintergrundmessung darstellt). Durch die Korrektur der CS-Aktivität wurde die Assay-Variabilität bei Mundschleimhautabstrichen weiter reduziert. Die für das Validierungsexperiment verwendeten Proben von Statin- und Nicht-Statin-Anwendern ergaben bei Statin-Anwendern im Vergleich zu Nicht-Anwendern eine bemerkenswerte, aber nicht signifikant höhere CIII-Aktivität. Dies stand im Gegensatz zu dem, was in Muskelbiopsien von Statin-Anwendern beobachtet wurde7,8 und stand in keinem Zusammenhang mit dem Mitochondriengehalt, da kein Unterschied in der CS-Aktivität zwischen Statin-Anwendern und Nicht-Anwendern festgestellt wurde29. Außerdem gab es keinen Zusammenhang zwischen der CIII- oder CS-Aktivität und der Verwendung von Statinen oder Muskelbeschwerden.

Der spektrophotometrische CIII-Enzymaktivitätstest basierte auf zuvor beschriebenen Methoden, die für andere mitochondriale Komplexe (I und IV) entwickelt wurden24,26,27. Für CI und CIV gehören dazu Dipstick-Assays mit Immunocapturing von CI und CIV, die anschließend zur Auslösung einer enzymatischen Reaktion verwendet werden, deren gefärbter Niederschlag quantifiziert wird26. Für CIII fehlt eine ähnliche Messstabmethode, weshalb wir einen anderen Assay zur Messung der CIII-Aktivität entwickelt haben. Wir haben die Extraktionspufferlösung und das Protokoll zur Herstellung der Mitochondrienfraktion auf diesen Teststäbchen-Assays basiert und zusätzlich einen Töpferschritt hinzugefügt, um die Ausbeute weiter zu erhöhen (Daten nicht gezeigt) und folglich die Empfindlichkeit zu verbessern35,36. Ein Nachteil unseres Assays besteht darin, dass er nicht auf Immunocapture basiert, was den von uns beobachteten höheren Variationskoeffizienten (ca. 39 % gegenüber 10 % in der Literatur) und die überlappende CIII-Aktivität zwischen Statin-Anwendern und Nicht-Anwendern erklären könnte26,37,38 .

Ein aktueller Übersichtsartikel über die Probenauswahl und die Auswahl von Tests zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in menschlichem Material34 betont auch die Einschränkungen der Probengröße bei der Auswahl einer Alternative zur Muskelbiopsie. Sie befassen sich mit der Herausforderung vieler vielversprechender Techniken, die Blutplättchen oder Leukozyten verwenden, da die Reproduzierbarkeit nicht erhöht werden kann oder die Skalierung schwierig ist. Zwei Verbesserungen des Mundschleimabstrichtests könnten die Respirometrie in gefrorenen Proben und die Entfernung von Bakterien aus den Proben sein, da bakterielle Kontaminationen nachweislich die Messungen stören und die Spezifität verringern34,39,40,41.

Einschränkungen dieser Studie bestehen darin, dass wir keine Muskelbiopsien von Statinkonsumenten und Nichtstatinkonsumenten erhalten konnten, indem wir Kontrollen zur gewebeübergreifenden Validierung der CIII-Aktivität verwendeten. Aufgrund der hohen Umschlagsrate der oralen Epithelschicht ist auch eine sorgfältige Interpretation der Daten erforderlich. Die durch Statin induzierte CIII-Hemmung ist teilweise eine Folge der Langzeitexposition von Muskelgewebe gegenüber Statinen und daher mit einer intramyozellulären Statinakkumulation aufgrund des langsameren Proteinumsatzes in diesem Gewebe verbunden42,43. Andererseits weist die orale Epithelschicht mit bukkalen Schleimhautzellen eine hohe Zellumschlagsrate von etwa 2,7 h44 auf. Infolgedessen steht den Statinen nur eine begrenzte Zeit zur Akkumulation zur Verfügung, und es bleibt fraglich, ob Mundschleimhautabstriche ein adäquater Ersatz für Muskelbiopsien bei der Diagnose einer Statin-induzierten CIII-Hemmung sind.

Auch die Probenahme und Verarbeitung von Mundschleimhautabstrichen könnte weiter optimiert werden. Das Vorhandensein von Spuren roter Blutkörperchen in den Proben war mit höheren CIII- und CS-Aktivitätswerten verbunden. Da die Absorption von CIII bei einer Wellenlänge gemessen wurde, die sowohl der Cytochrom-C-Reduktion als auch dem Hämoglobin der roten Blutkörperchen (550 nm, rotes Licht) entsprach, könnte das Vorhandensein von Blut das Signal fälschlicherweise erhöht haben45. Da bei CS-Messungen eine Wellenlänge verwendet wird, die auch der Absorption von Hämoglobin sehr nahe kommt (412 vs. 550 nm), reicht sie nicht aus, um Blutspuren zu korrigieren45. Daher mussten Proben, die Blutspuren (Hämoglobin) enthielten, bei der visuellen Untersuchung ausgeschlossen werden. Ein weiterer Faktor ist die Verarbeitungsphase der Mundschleimhautabstriche bis zur Isolierung der Mitochondrien, da diese im Laufe der Zeit durch zusätzliches Töpfern und längere Rotationszeiten angepasst wurde, um die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Die Validierungsproben wurden jedoch nach einem der ersten Protokolle verarbeitet und daher war ihre Ausbeute möglicherweise zu gering, was zu Messungen unterhalb der Nachweisgrenzen des Assays führte. Darüber hinaus wurden insgesamt 13 Patienten (13 %) aufgrund unermesslich niedriger CIII-Aktivitäten ausgeschlossen, obwohl sie gleichmäßig auf Statinkonsumenten (drei symptomatisch und sechs asymptomatisch) und Kontrollpersonen (vier) verteilt waren.

Diese Studie ist ein Schritt in Richtung der zukünftigen Entwicklung eines empfindlicheren Dipstick-Assays. Der aktuelle Test verwendet die weniger invasiven Mundschleimhautabstriche, um mitochondriale CIII-Aktivitäten konsistent zu messen. Die Einbeziehung einer Immunocapture-Methode könnte zusammen mit der Verbesserung der Probengewinnung ohne Blut und der Probenaufreinigung durch Töpfern möglicherweise die Assay-Variation weiter verringern. Die hier erfassten enzymatischen Reaktions- und Spektrophotometriemessungen sind auch in einem Dipstick-Assay anwendbar, wie sie für Komplex I und IV angewendet werden24,26. Darüber hinaus lohnt es sich, die Möglichkeit einer Messung in gefrorenen Proben zu prüfen und die Bakterienentfernung zu optimieren. Es könnte dann empfohlen werden, Patienten mit bekanntem CIII-Mangel zu verwenden, um die Korrelation mit diesem zuvor diagnostizierten mitochondrialen Defekt zu bewerten, wie dies für CI und CIV24,26 getan wurde, oder die CIII-Aktivität durch Abstriche von Patienten mit durch Biopsie nachgewiesener medikamenteninduzierter CIII-Hemmung im Skelett zu beurteilen Muskel. Es wird diskutiert, ob Statine die Ursache für die gemeldeten SAMS sind16,46. Die Optimierung des aktuellen Assays könnte dabei helfen, zwischen Muskelsymptomen zu unterscheiden, die auf eine Statin-induzierte CIII-Hemmung oder andere Ursachen zurückzuführen sind7.

Das derzeit beschriebene Protokoll kann die Aktivität des Mitochondrienkomplexes III auf nicht-invasive Weise angemessen messen, bedarf jedoch einer weiteren Optimierung und Validierung im klinischen Umfeld.

2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (TRIS UltraPure) (Invitrogen, #15504020); Antimycin A (Sigma-Aldrich, #A8674); Cytochrom C (Sigma-Aldrich, #C7752); 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzochinon (Decylubichinon) (Enzo Life Sciences, #BML-CM115-0010); Kaliumphosphat dibasisch (Sigma-Aldrich, #P3786-M); Kaliumphosphat einbasisch (Acros Organics, Nr. 205925000); Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, #276855); Ethylendiamintetraessigsäure, 2Na (Na-EDTA) (Merck, Nr. 324503); Heparin (Sigma-Aldrich, #H3393); Ethanol (Merck, Nr. 100983); Kaliumborhydrid (Sigma-Aldrich, #60080); Natriumazid (Sigma-Aldrich, #S2002); Saccharose (Acros Organics, #220900025); Tween-20 (Sigma-Aldrich, #P1379); Rauchende Salzsäure (37 %) (Merck, Nr. 100317); Kaliumhydroxid (Merck, Nr. 105032); n-Dodecyl-β-d-maltosid (Sigma-Aldrich, #D4641); Natriumchlorid (Sigma-Aldrich, #S9888); HEPES (Sigma-Aldrich, #H3375); cOmplete™, mini, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich, Nr. 11836170001); DNA/RNA-Bukkalabstriche (Isohelix™, #SK-1S); DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX™ Supplement, Pyruvat (Gibco™ Life Technologies, Nr. 31966047); Fetales Rinderserum (FBS; Greiner Bio-One, Alpen aan de Rijn, Niederlande, Nr. 758093); Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1× (PBS; Laborunterstützung und Medienvorbereitung LEM, RIMLS, Radboudumc, Nijmegen, Niederlande); 0,05 % Trypsin–EDTA (1×) (Gibco™ Life Technologies, Nr. 25300054).

HeLa-Zellen (American Type Culture Collection, CCL-2) wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre von 5 % (v/v) CO2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 25 mM Glucose, GlutaMAX™ und 1 mM Pyruvat gehalten ergänzt mit 10 % (v/v) FBS. Bei Konfluenz wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit Trypsin dissoziiert und nach 6–7 Minuten Inkubation bei 37 °C im Verhältnis 1:10 passagiert. Die Zellen wurden außerdem zentrifugiert (5 Minuten, 1000 g) und zur Zählung in DMEM resuspendiert. Die Zellen wurden in Eppendorf-1,5-ml-Röhrchen geteilt, etwa 8 Millionen Zellen/Röhrchen, und erneut zentrifugiert, bevor sie in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren wurden. Diese Zellen wurden für Experimente bei –20 °C gelagert.

Bei jedem Patienten werden mindestens 4 Mundschleimhautabstriche durchgeführt. Es ist wichtig, dass der Mund gespült wird, bevor die Proben entnommen werden, um zu verhindern, dass Essens- oder Getränkerückstände die Probe verunreinigen. Als nächstes wird jeder Tupfer in 175 µL Extraktionspuffer (pH 7,4) gegeben, der aus Laurylmaltosid (Dodecylmaltosid) (1,5 % w/v), 100 mM NaCl, 25 mM HEPES und einer Proteaseinhibitor-Cocktailtablette besteht. Jeder Mundschleimhautabstrich wird kurz gewirbelt (ca. 20 s) und in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge 5 Minuten lang bei 8500 g zentrifugiert. Die Überstände und Pellets von vier Mundschleimhautabstrichen werden kombiniert und in 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) suspendiert. Diese Tris-HCl-Tupfer-Suspension wird 6–8 Mal getöpfert und dann 20 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Röhrchen in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge 20 Minuten lang zentrifugiert, 16.000 g. Alle Zellfraktionen werden im Pellet gesammelt und verworfen und der Überstand mit Mitochondrien wird für die folgenden Analysen verwendet.

Die CIII-Aktivitätsmessungen werden durch einen spektrophotometrischen Assay bestimmt, der auf der folgenden enzymatischen Reaktion basiert: DUH2 + Cytochrom c (oxidiert) → DU + Cytochrom c (reduziert) + 2H+.

Für die 96-Well-Konfiguration: In einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem F-Boden (Greiner Bio-One, Essen, Deutschland) werden 72,5 µL Reaktionsgemisch in jedes Well pipettiert. Die Reaktionsmischung wird am Tag der Experimente frisch hergestellt und besteht aus Milli-Q (14,6 % v/v), 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8; 66,4 % v/v), 0,3 M NaN3 (1,3 % v/v). ), 0,1 M Na-EDTA (1,3 % v/v), 2 % Tween-20 (2,7 % v/v), 1 mM Cytochrom C (13,3 % v/v) und reduziertes DUH2 (0,4 % v/v). Fügen Sie DUH2 5 Minuten vor der Verwendung hinzu und inkubieren Sie es auf Eis, um Ausfällungen zu verhindern. 2,5 µL Milli-Q (MQ) oder Antimycin A (AA; minimale Konzentration von 10 nM) werden jeweils in die Aktivitäts- oder Blindvertiefungen gegeben. AA ist ein Inhibitor von CIII und wird zur Messung der basalen Cytochrom-C-Reduktion (Hintergrund) verwendet, um die tatsächliche CIII-Aktivität zu bestimmen.

Für die 384-Well-Konfiguration: In einer 384-Well-Mikroplatte mit schwarzem/klarem Boden (Greiner Bio-One, Essen, Deutschland) werden 40 µL Reaktionsmischung in jedes Well gegeben. Dieses Reaktionsgemisch ist ohne Cytochrom C: Milli-Q (16,8 % v/v), 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8; 76,6 % v/v), 0,3 M NaN3 (1,5 % v/v), 0,1 M Na- EDTA (1,5 % v/v), 2 % Tween-20 (3,1 % v/v) und reduziertes DUH2 (0,4 % v/v). 5 µL MQ oder AA (Mindestkonzentration 10 nM) werden jeweils in die Aktivitäts- oder Blindvertiefungen gegeben.

Für beide Tests (nach Zugabe von AA oder MQ): Die Platte wird zum Aufwärmen und Mischen in einen Plattenleser Bio-Rad Benchmark Plus mit der Software Microplate Manager 5.2 Build 103 (Bio-Rad Laboratories BV, Veenendaal, Niederlande) gegeben (25 °C). Nach 5 Minuten werden 25 µL (96-Well-Konfiguration) oder 40 µL (384-Well-Konfiguration) Probe hinzugefügt. Die katalytische Reaktion wurde in der 384-Well-Konfiguration gerade erst durch die Zugabe von 7,7 μL 1 mM oxidiertem Cytochrom c gestartet und die Bildung von reduziertem Cytochrom c wurde bei 550 nm und 25 °C im Plattenlesegerät gemessen. Cytochrom C wurde bereits in der 96-Well-Konfiguration als Bestandteil der Reaktionsmischung hinzugefügt. Kinetische Messungen wurden alle 20 s über eine Gesamtdauer von 20 min durchgeführt.

Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, der Unterschied zwischen Probe und Leerwert stellt die Aktivität von CIII dar. Dazu werden die Messungen auf einer Zeitkurve aufgetragen und eine Steigung für mindestens die ersten 10 Datenpunkte in Graphpad Prism berechnet. Ausreißer wurden ausgeschlossen. Die Steigung wird in der folgenden Formel zur Berechnung der CIII-Aktivität verwendet.

ΔE min−1: durchschnittlicher Anstieg der Absorption bei 550 nm pro Minute in der Reaktionsprobe; Verdünnung: Verdünnung der mitochondrialen Fraktion, wenn nicht verdünnt, behalten Sie den Wert 1; T: Gesamtreaktionsvolumen (in µL), normalerweise 92,7 µL; x: Volumen der hinzugefügten mitochondrialen Fraktion in µL, normalerweise 40 µL; 0,0191 µmol−1 cm−1: e550 nm reduziertes Cytochrom c.

Der Durchschnitt der Negativkontrollvertiefungen (ohne Zellen) wird von allen anderen Aktivitätswerten abgezogen. Als nächstes gilt die absolute Aktivität = Aktivität der Versuchsvertiefungen (MQ) − Aktivität der Leervertiefungen (AA). CIII-Aktivitäten gelten als ungültig, wenn sie gleich oder kleiner als 0 sind.

Citrat-Synthase (CS) ist ein einzigartiges mitochondriales Enzym und daher ein Marker für die mitochondriale Masse. Es wird als Korrekturfaktor für die Variabilität des durch Mundschleimhautabstriche ermittelten Zellinhalts verwendet. Bisherige Proteinmessungen konnten den Variationskoeffizienten nicht ausreichend senken.

Die CS-Aktivität wurde durch einen spektrophotometrischen Assay bestimmt, der auf den folgenden enzymatischen Reaktionen basierte: Acetyl-CoA + Oxalacetat + H2O ↔ Citrat + CoASH + H+ und CoASH + DTNB ↔ DTNB-SH + CoA.

Der zuvor erhaltene Überstand mit Mitochondrienfraktion (für CIII-Messungen) wird verwendet und 50 µL in jede Vertiefung einer 384-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Alle Reagenzien werden in 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) gelöst. Die Testmischung, die 2 ml Milli-Q, 500 µL 1 mM DTNB und 10,42 µL 10 % Triton X-100 enthält, wird in 41,7 µL Vertiefung − 1 gegeben. Abschließend werden 5,6 µL 3 mM Acetyl-CoA hinzugefügt. Die basale DTNB-SH-Produktion wurde 20 Minuten lang (kinetisch) bei 412 nm in einem Bio-Rad Benchmark Plus-Plattenlesegerät mit der Software Microplate Manager 5.2 Build 103 gemessen. Anschließend wurden 2,8 μl 10 mM Oxalacetat zugegeben, um die katalytische Reaktion zu starten, und nach dem Mischen wurde die DTNB-SH-Produktion weitere 20 Minuten lang bei 412 nm gemessen (kinetisch). Der Unterschied zwischen den Steigungen, die für beide aufgezeichneten Messungen in GraphPad Prism ermittelt wurden, ergab die CS-Aktivität pro Probe.

Die erhaltenen CIII-Werte werden durch die CS-Aktivitätswerte dividiert, was die korrigierte CIII-Aktivität ergibt.

Die vorherigen Proben wurden auch im SpectraMax iD5-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices; San Jose, CA) gemessen, um die Fluoreszenz der Cytochrom-C-Reduktion zu bestimmen. Die Wellenlängen für Anregung und Emission betrugen 350 nm bzw. 450 nm47.

In die Studie wurden hundert erwachsene Teilnehmer der 102. Auflage der Nijmegener Viertagemärsche (Nimwegen, Niederlande) einbezogen. Statinkonsumenten wurden eingeschlossen, wenn sie ≥ 3 Monate vor Studienteilnahme Statine eingenommen hatten. Statinkonsumenten wurden anhand des Statin-Myalgie-Index-Scores9 anhand des Vorhandenseins, der Lokalisierung und des Auftretens von Muskelkrämpfen, Schmerzen und/oder Schwäche als symptomatisch oder asymptomatisch eingestuft. BMI, Hüftumfang und Blutdruck wurden 1 oder 2 Tage vor dem Ereignis gemessen (Tabelle 1). Zur Bestimmung des körperlichen Aktivitätsniveaus wurde der Kurzfragebogen zur Beurteilung gesundheitsfördernder körperlicher Aktivität (SQUASH) verwendet48. Die Teilnehmer wurden gebeten, vier Mundschleimhautabstriche zu entnehmen. Die Probenentnahme erfolgte 30 Sekunden lang pro Abstrich, auf nüchternen Magen und nach zweimaligem Spülen des Mundes. Die Mundschleimhautabstrichproben wurden als zusätzliche Messung im Rahmen einer größeren Studie entnommen, die bei ClinicalTrials.gov (NCT05011643) registriert ist. Die Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des Universitätsklinikums Radboud genehmigt und die Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Alle Methoden wurden gemäß den relevanten Richtlinien und Vorschriften des Radboud University Medical Center durchgeführt. Die Entnahme von Wangenabstrichproben und Fragebögen erfolgte 1 oder 2 Tage vor der Veranstaltung.

Die Proben wurden in 4 °C-Extraktionspuffer (siehe oben) gegeben, 20 s lang gevortext und 5 min lang zentrifugiert (8500 g, 4 °C). Der Überstand wurde isoliert und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Um die Mitochondrien zu isolieren, wurden die Proben 12 Minuten lang zentrifugiert (16.000 g, 4 °C). Für jeden Teilnehmer wurden die Proben gepoolt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Durchführung der CIII-Messungen bei –80 °C gelagert.

Alle Daten werden mit GraphPad Prism Version 5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) und IBM SPSS® Statistics (Version 25, Armonk, NY, USA) analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert mit Standardfehler des Mittelwerts (± SEM) dargestellt. Die CIII-Aktivität und die CS-Aktivität werden wie oben beschrieben bestimmt. Die Daten wurden anhand dieser CS-Aktivitätsmessungen leer korrigiert und normalisiert.

Der Intra-Assay-Variationskoeffizient wird auf der Grundlage des Variationskoeffizienten jeder Bedingung für jedes biologisch unabhängige Experiment berechnet. Der Variationskoeffizient zwischen den Tests wird auf der Grundlage des Mittelwerts von drei Wiederholungen pro Bedingung jedes Experiments berechnet.

Patienten mit einer negativen mittleren CIII-Aktivität wurden ausgeschlossen. Informationen zum Statinkonsum wurden den Forschern bis zur Durchführung einer statistischen Analyse ausgeblendet. Unterschiede zwischen Statinkonsumenten und Kontrollpersonen wurden mithilfe eines unabhängigen Stichproben-T-Tests analysiert. Unterschiede zwischen Statin-Anwendern mit Muskelsymptomen, asymptomatischen Statin-Anwendern und Nicht-Statin-Anwendern wurden mit dem χ2-Test und der einfaktoriellen ANOVA ermittelt. Bonferroni-Post-hoc-Tests wurden durchgeführt, um Mehrfachvergleiche zu korrigieren. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde ein „α“-Wert von 0,05 verwendet. Die Korrelationen wurden mit einem zweiseitigen, nichtparametrischen Spearman-Rho-Test untersucht und waren auf einem Niveau von 0,01 signifikant.

Alle in dieser Studie verwendeten Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Neustadt, J. & Pieczenik, SR Medikamenteninduzierte mitochondriale Schädigung und Erkrankung. Mol. Nutr. Lebensmittelres. 52, 780–788. https://doi.org/10.1002/mnfr.200700075 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stroes, ES et al. Statin-assoziierte Muskelsymptome: Auswirkungen auf die Statintherapie – Stellungnahme des Konsensgremiums der European Atherosclerosis Society zu Bewertung, Ätiologie und Management. EUR. Herz J. 36, 1012–1022. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehv043 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Studienteilnehmer zur Cholesterinbehandlung C, et al. Die Auswirkungen der Senkung des LDL-Cholesterins mit einer Statintherapie bei Menschen mit geringem Risiko für Gefäßerkrankungen: Metaanalyse einzelner Daten aus 27 randomisierten Studien. Lancet (Lond., Engl.) 380, 581–590. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(12)60367-5 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Buettner, C., Davis, RB, Leveille, SG, Mittleman, MA & Mukamal, KJ Prävalenz von Muskel-Skelett-Schmerzen und Statinkonsum. J. Gen. Praktikant. Med. 23, 1182–1186. https://doi.org/10.1007/s11606-008-0636-7 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Armitage, J. Die Sicherheit von Statinen in der klinischen Praxis. Lancet (Lond., Engl.) 370, 1781–1790. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(07)60716-8 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Thompson, PD, Clarkson, P. & Karas, RH Statin-assoziierte Myopathie. JAMA 289, 1681–1690. https://doi.org/10.1001/jama.289.13.1681 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schirris, TJJ et al. Eine Statin-induzierte Myopathie ist mit einer Hemmung des Mitochondrienkomplexes III verbunden. Zellmetabolismus 22, 399–407. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2015.08.002 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Allard, NAE et al. Statine beeinträchtigen die Leistungsfähigkeit der Skelettmuskulatur: Hinweise auf Störungen im Energiestoffwechsel. J. Clin. Endokrinol. Metab. 103, 75–84. https://doi.org/10.1210/jc.2017-01561 (2017).

Artikel Google Scholar

Rosenson, RS et al. Eine Einschätzung der Statin Muscle Safety Task Force: Aktualisierung 2014. J. Clin. Lipidol. 8, S58-71. https://doi.org/10.1016/j.jacl.2014.03.004 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Taylor, BA & Thompson, PD Statin-assoziierte Muskelerkrankungen: Fortschritte in Diagnose und Management. Neurotherapeutika 15, 1006–1017. https://doi.org/10.1007/s13311-018-0670-z (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Warden, BA et al. Beurteilung und Behandlung von Statin-assoziierten Muskelsymptomen (SAMS): Eine klinische Perspektive von der National Lipid Association. J. Clin. Lipidol. 17, 19–39. https://doi.org/10.1016/j.jacl.2022.09.001 (2023).

Artikel PubMed Google Scholar

Meza-Contreras, A. et al. Management einer Statin-Intoleranz: Eine systematische Überprüfung. Endocrine 79, 430–436. https://doi.org/10.1007/s12020-022-03263-w (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Penson, PE et al. Schrittweise Diagnose und Behandlung des Nocebo/Drucebo-Effekts bei Patienten mit Statin-assoziierten Muskelsymptomen: Ein Positionspapier des International Lipid Expert Panel (ILEP). J. Kachexie. Sarkopenie-Muskel 13, 1596–1622. https://doi.org/10.1002/jcsm.12960 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosenson, RS et al. Der klinische Index für Statin-assoziierte Muskelsymptome (SAMS-CI): Überarbeitung für die klinische Verwendung, Inhaltsvalidierung und Zuverlässigkeit zwischen Bewertern. Herz-Kreislauf. Drogen Ther. 31, 179–186. https://doi.org/10.1007/s10557-017-6723-4 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sivashanmugarajah, A. et al. Vorgeschlagener klinischer Ansatz für die Diagnose und Behandlung von „Statin-Intoleranz“ mit Schwerpunkt auf muskelbezogenen Nebenwirkungen. Praktikant. Med. J. 49, 1081–1091. https://doi.org/10.1111/imj.14429 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Reith, C. et al. Wirkung der Statintherapie auf Muskelsymptome: Eine Metaanalyse der Daten einzelner Teilnehmer aus groß angelegten, randomisierten, doppelblinden Studien. Lanzette 400, 832–845. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(22)01545-8 (2022).

Artikel Google Scholar

Ramkumar, S., Raghunath, A. & Raghunath, S. Statintherapie: Überprüfung der Sicherheit und möglicher Nebenwirkungen. Acta Cardiol. Sünde. 32, 631–639. https://doi.org/10.6515/acs20160611a (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Fitchett, DH, Hegele, RA & Verma, S. Statin-Intoleranz. Auflage 131, e389–e391. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.114.013189 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Gulizia, MM et al. ANMCO/ISS/AMD/ANCE/ARCA/FADOI/GICR-IACPR/SICI-GISE/SIBioC/SIC/SICOA/SID/SIF/SIMEU/SIMG/SIMI/SISA Gemeinsames Konsensdokument zu Cholesterin und kardiovaskulärem Risiko: Diagnostisch-therapeutischer Weg in Italien. EUR. Herz J. Suppl. 19, D3–D54. https://doi.org/10.1093/eurheartj/sux029 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krähenbühl, S., Talos, C., Wiesmann, U. & Hoppel, CL Entwicklung und Bewertung eines spektrophotometrischen Tests für Komplex III in isolierten Mitochondrien, Geweben und Fibroblasten von Ratten und Menschen. Klin. Chim. Acta 230, 177–187. https://doi.org/10.1016/0009-8981(94)90270-4 (1994).

Artikel PubMed Google Scholar

Rodenburg, RJ Biochemische Diagnostik mitochondrialer Erkrankungen. J. Erben. Metab. Dis. 34, 283–292. https://doi.org/10.1007/s10545-010-9081-y (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodenburg, RJ et al. Ein multizentrischer Vergleich diagnostischer Methoden zur biochemischen Beurteilung vermuteter mitochondrialer Erkrankungen. Mitochondrium 13, 36–43. https://doi.org/10.1016/j.mito.2012.11.004 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spinazzi, M., Casarin, A., Pertegato, V., Salviati, L. & Angelini, C. Bewertung der enzymatischen Aktivitäten der mitochondrialen Atmungskette an Geweben und kultivierten Zellen. Nat. Protokoll. 7, 1235–1246. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.058 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goldenthal, MJ et al. Nicht-invasive Bewertung der Enzymdysfunktion der bukkalen Atmungskette bei mitochondrialen Erkrankungen: Vergleich mit Studien zur Muskelbiopsie. Mol. Genet. Metab. 105, 457–462. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2011.11.193 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodinová, M. et al. Nicht-invasives Screening auf Cytochrom-C-Oxidase-Mangel bei Kindern mithilfe eines Dipstick-Immunocapture-Assays. Folia Biol (Praha) 60, 268–274 (2014).

PubMed Google Scholar

Willis, JH et al. Isolierte Mängel der OXPHOS-Komplexe I und IV werden durch einfache Enzymaktivitäts-Immunocapture-Assays genau und schnell identifiziert. Biochim. Biophys. Acta Bioenerget. 1787, 533–538. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2008.10.009 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Yorns, WR et al. Wangenabstrichanalyse eines mitochondrialen Enzymmangels und DNA-Defekten bei einem Kind mit Verdacht auf myoklonische Epilepsie und Ragged Red Fibers (MERRF). J. Child Neurol. 27, 398–401. https://doi.org/10.1177/0883073811420870 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Marin-Garcia, J., Goldenthal, MJ, Pierpont, MEM & Ananthakrishnan, R. Beeinträchtigte Mitochondrienfunktion bei idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie: Biochemische und molekulare Analyse. J. Herzversagen. 1, 285–291. https://doi.org/10.1016/1071-9164(95)90003-9 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Larsen, S. et al. Biomarker des Mitochondriengehalts im Skelettmuskel gesunder junger Menschen. J. Physiol. 590, 3349–3360. https://doi.org/10.1113/jphysiol.2012.230185 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradford, MM Eine schnelle und empfindliche Methode zur Quantifizierung von Proteinmengen im Mikrogrammbereich unter Verwendung des Prinzips der Protein-Farbstoff-Bindung. Anal. Biochem. 72, 248–254. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999 (1976).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smith, PK et al. Proteinmessung mit Bicinchoninsäure. Anal. Biochem. 150, 76–85. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90442-7 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, H. et al. Absetzen von Statinen in der Routinepflege: Eine Kohortenstudie. Ann. Praktikant. Med. 158, 526–534. https://doi.org/10.7326/0003-4819-158-7-201304020-00004 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Parikh, S. et al. Diagnose und Behandlung mitochondrialer Erkrankungen: Eine Konsenserklärung der Mitochondrial Medicine Society. Genet. Med. 17, 689–701. https://doi.org/10.1038/gim.2014.177 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, OS & Stiles, L. Verwendung menschlicher Proben zur Bewertung der mitochondrialen Bioenergetik: Goldstandards, Einschränkungen und Zukunftsperspektiven. Leben (Basel) https://doi.org/10.3390/life11090949 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Burden, D. Leitfaden zum Aufschluss biologischer Proben – 2012. Random Primers 12, 25 (2012).

Google Scholar

Sahajpal, NS et al. SalivaAll: Klinische Validierung eines empfindlichen Tests für Speichel, der im Gesundheitswesen und in der Gemeinde gesammelt wird, mit gebündeltem Nutzen für die Massenüberwachung von SARS-CoV-2. MedRxiv https://doi.org/10.1101/2020.08.26.20182816 (2020).

Artikel Google Scholar

Gellerich, FN, Mayr, JA, Reuter, S., Sperl, W. & Zierz, S. Das Problem der Interlab-Variation bei Methoden zur Diagnose mitochondrialer Erkrankungen: Enzymatische Messung von Atmungskettenkomplexen. Mitochondrium 4, 427–439. https://doi.org/10.1016/j.mito.2004.07.007 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marusich, MF, Murray, J., Xie, J. & Capaldi, RA Neuartige Antikörper-basierte Strategien für die schnelle Diagnose mitochondrialer Erkrankungen und Funktionsstörungen. Int. J. Biochem. Zellbiol. 41, 2081–2088. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2009.05.009 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Acin-Perez, R. et al. Ein neuartiger Ansatz zur Messung der mitochondrialen Atmung in gefrorenen biologischen Proben. Embo J 39, e104073. https://doi.org/10.15252/embj.2019104073 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mahfuz, I., Cheng, W. & White, SJ Identifizierung der DNA-Kontamination durch Streptococcus parasanguinis in menschlichen bukkalen DNA-Proben. BMC Res. Anmerkungen 6, 481. https://doi.org/10.1186/1756-0500-6-481 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

García-Closas, M. et al. Sammlung genomischer DNA von Erwachsenen in epidemiologischen Studien mittels bukkaler Zytobürste und Mundwasser1. Krebs-Epidemiol. Biomark. Vorher. 10, 687–696 (2001).

Google Scholar

Hengstler, JG, Sjögren, AK, Zink, D. & Hornberg, JJ In-vitro-Vorhersage der Organtoxizität: Die Herausforderungen der Skalierung und sekundäre Mechanismen der Toxizität. Bogen. Toxicol. 94, 353–356. https://doi.org/10.1007/s00204-020-02669-7 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morgan, HE, Rannels, DE & Kao, RL Faktoren, die den Proteinumsatz im Herzmuskel steuern. Zirkel. Res. 35, III-22–III−31. https://doi.org/10.1161/res.35.3_supplement.iii-22 (1974).

Artikel Google Scholar

Dawes, C. Schätzungen anhand von Speichelanalysen zur Umsatzzeit des Mundschleimhautepithels beim Menschen und zur Anzahl der Bakterien in einem zahnlosen Mund. Bogen. Oral. Biol. 48, 329–336. https://doi.org/10.1016/s0003-9969(03)00014-1 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roggan, A., Friebel, M., Doerschel, K., Hahn, A. & Mueller, G. Optische Eigenschaften von zirkulierendem menschlichem Blut im Wellenlängenbereich 400–2500 nm. J. Biomed. Opt. 4, 25 (1999).

Artikel Google Scholar

Naci, H., Brugts, J. & Ades, T. Vergleichende Verträglichkeit und Schäden einzelner Statine. Zirkel. Herz-Kreislauf. Qual. Ergebnisse 6, 390–399. https://doi.org/10.1161/CIRCOUTCOMES.111.000071 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Esteve-Núñez, A., Sosnik, J., Visconti, P. & Lovley, DR Fluoreszenzeigenschaften von C-Typ-Cytochromen zeigen ihre potenzielle Rolle als extrazytoplasmatische Elektronensenke in Geobacter Sulfurreducens. Umgebung. Mikrobiol. 10, 497–505. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2007.01470.x (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wendel-Vos, GC, Schuit, AJ, Saris, WH & Kromhout, D. Reproduzierbarkeit und relative Gültigkeit des kurzen Fragebogens zur Bewertung gesundheitsfördernder körperlicher Aktivität. J. Clin. Epidemiol. 56, 1163–1169. https://doi.org/10.1016/s0895-4356(03)00220-8 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

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Die Autoren danken Tom van Haaren für seinen Beitrag bei der Sammlung und Analyse der Daten der Pilotstudie und Charlotte Hoogstraten für die Verarbeitung der frisch entnommenen Abstriche und deren angemessene Lagerung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Silvie Timmers und Tom JJ Schirris.

Abteilung für Herz-Thorax-Chirurgie, Radboud University Medical Center, Geert Grooteplein Zuid 10, PO Box 9101, 6500 HB, Nijmegen, Niederlande

Tim Somers, Sailay Siddiqi und Wim J. Morshuis

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, Niederlande

Tim Somers, Margit CM Janssen, Frans GM Russel und Tom JJ Schirris

Radboud Center for Mitochondrial Medicine, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, Niederlande

Tim Somers, Sailay Siddiqi, Frans GM Russel und Tom JJ Schirris

Abteilung für Physiologie, Radboud-Institut für Gesundheitswissenschaften, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Neeltje AE Allard & Maria TE Hopman

Abteilung für Human- und Tierphysiologie, Universität Wageningen, Wageningen, Niederlande

Silvie Timmers

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ST- und TJJS-Konzeptualisierung der Studie. TS, MJ und NA führten die Experimente durch. TJJS hat die Proben gesammelt. TJJS führte eine Pilotstudie durch. TS, NA, MJ, ST und TJJS analysierten die Daten und interpretierten die Ergebnisse. TS hat das Manuskript geschrieben. TS hat die Zahlen vorbereitet. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Tim Somers.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Somers, T., Allard, NAE, Siddiqi, S. et al. Mitochondriale Komplex-III-Aktivität: von invasiven Muskelbiopsien bis hin zu patientenfreundlichen Wangenabstrichanalysen. Sci Rep 13, 9638 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36741-w

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Eingegangen: 09. Januar 2023

Angenommen: 08. Juni 2023

Veröffentlicht: 14. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36741-w

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Mitochondriale Komplex-III-Aktivität: von invasiven Muskelbiopsien bis zum Patienten